核酸降解和核苷酸代谢.ppt

感谢大家观看第32页,共32页，2024年2月25日，星期天关于核酸降解和核苷酸代谢核酸水解糖苷键、磷酸酯键均可酸水解最不稳定为嘌啉与脱氧核糖间的糖苷键酸水解RNA的磷酸酯键易碱解，DNA耐受碱浓度0.3-1M,37℃18－24h完成碱水解第2页,共32页，2024年2月25日，星期天外源核酸在小肠发生有限的消化吸收核酸在核酸酶的作用下，水解为寡核苷酸或单核苷酸单核苷酸可进一步降解为碱基、戊糖和磷酸。核酸酶解第3页,共32页，2024年2月25日，星期天根据核酸酶作用的位置不同，又可将核酸酶分为核酸外切酶（exonuclease）和核酸内切酶（endonuclease）。有些核酸酶能从DNA或RNA链的一端逐个水解下单核苷酸，所以称为核酸外切酶。核酸内切酶催化水解多核苷酸内部的磷酸二酯键。核酸外切酶和核酸内切酶第4页,共32页，2024年2月25日，星期天限制性内切酶20世纪70年代，在细菌中陆续发现了一类核酸内切酶，能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链DNA的核酸内切酶。称为限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）第5页,共32页，2024年2月25日，星期天限制性内切酶的发现1953年，Arber研究噬菌体与细菌的关系，发现限制现象。1962年，Arber发现大肠杆菌对外来侵入的DNA有限制作用。预言了DNA限制性内切酶的存在。1968年，H·O·Smith分离出第一个内切酶。1971年，D·Nathans应用内切酶切割SV-40病毒的DNA，获得了第一个DNA的内切图谱限制性内切酶的发现启动了基因工程时代三人共享了1978年的诺贝尔奖第6页,共32页，2024年2月25日，星期天限制与修饰现象限制酶天然存在于细菌体内，与相伴存在的甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统。修饰和限制现象是50年代初发现的一种细菌自卫的方式。细菌内两种不同功能的酶：限制性内切酶；甲基化酶。甲基化酶能识别限制性内切酶所识别的碱基顺序，并把其中某些碱基甲基化。被修饰酶甲基化了的DNA就不能被限制性内切酶降解第7页,共32页，2024年2月25日，星期天三类限制与修饰酶类型Ⅰ：多亚基双功能酶，甲基化和切割由同一酶完成。识别位点和切割位点不一致，没有固定切割位点类型Ⅱ：修饰和限制由两个分开的酶完成。能识别双链DNA的特殊序列，并可特异切割DNA类型Ⅲ：双亚基双功能酶，切割位点在识别位点下游24-26bp处。第8页,共32页，2024年2月25日，星期天限制性内切酶的命名HindⅢ前三个字母来自于菌种名称H.influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。EcoRI—EscherichiacoliRIHindⅢ—HaemophilusinfluensaedⅢSacI(II)—StreptomycesachromagenesI(Ⅱ)限制酶由三部分构成，即菌种名（斜写）、菌系编号、分离顺序。第9页,共32页，2024年2月25日，星期天限制性内切酶的特点识别长度为4-8个核苷酸的特异序列；许多识别序列具回文结构，如HindⅢ的识别序列：5`AAGCTT3`3`TTCGAA5切割产生的末端有粘端(cohesive/stickyend)如BamHI(G↓GATCC)和平端(bluntend)如SmaI(CCC↓GGG)第10页,共32页，2024年2月25日，星期天同裂酶与同尾酶来源不同但能识别和切割同一位点的酶称为同功异源酶(isoschizomer),有时也称同裂酶；有些限制酶识别序列不同，但是产生相同的粘性末端，这些酶称为同尾酶（isocaudamer)第11页,共32页，2024年2月25日，星期天基因工程常用工具酶酶主要用途限制性核酸内切酶识别DNA特定序列，切割DNA分子DNA连接酶连接两个DNA分子或片段大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ或Klenow酶制作DNA探针；合成cDNA第二链；填补双链DNA3`凹端；DNA测序。TaqDNA聚合酶聚合酶链式反应（PCR）多核苷酸激酶多核苷酸5`-OH磷酸化，制末端标记探针末端转移酶使3`-末端加同聚物尾S1核酸酶降解单链DNA或RNADNA酶Ⅰ在双链DNA上产生随机切口RNA酶A降解RNA逆转录酶补平反应，合成cDNA或制探针碱性磷酸酶切除核酸末端磷酸基第12页,共32页，2024年2月25日，星期天核苷酸的进一