三、基因工程的基本条件-工具酶和细胞.ppt

A 用于核酸操作的工具酶 C 用于基因转移的受体菌或细胞 DNA聚合酶 TaqDNA聚合酶 基本特性： 5‘→3‘的DNA聚合酶活性 5‘→3‘的核酸外切酶活性 耐高温78-94度 用途： PCR扩增 DNA序列测定 核酸酶 单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII） 大肠杆菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+ ExoVII 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 核酸酶 双链核酸外切酶：核酸外切酶 III（ExoIII） ExoVII 3’ 5’ 3’ 5’ Mg2+ 3’ 5’ 3’ 5’ 大肠杆菌的核酸外切酶 III 特异性地从3‘ 端外切 核酸酶 双链核酸外切酶：l 核酸外切酶（ lExo） lExo 3’ 5’ 3’ 5’ Mg2+ l核酸外切酶特异性地从5‘ 端外切 3’ 5’ 3’ 5’ 核酸酶 单链核酸内切酶：S1核酸酶 S1核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（Aspergillus oryzae） Zn2+必需 最适pH范围为4.0 - 4.3 需要NaCl 10 - 300 mM 降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍 降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍 核酸酶 单链核酸内切酶：S1核酸酶 S1核酸酶的基本反应：内切单链DNA或RNA 5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T… 3’ S1 Zn2+ 5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-C T-T-G-A-G-G-A-G-T… 3’ 5‘ … G-C-T-C A-G-C-T-C T-T-G-A-G G-A-G-T… 3’ 5‘ dNMPs 或 5‘ NMPs 核酸酶 单链核酸内切酶：S1核酸酶 S1核酸酶的基本反应：内切带缺口或缺刻的双链DNA或RNA 5‘ … G-C-T-C-A-G C-T-G-G-A-G-T… 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A… 5‘ 5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C A-C-C-T-C-A… 5‘ nick gap S1 Zn2+ 5‘ … G-C-T-C-A-G 3‘ … C-G-A-G-T-C T-G-G-A-G-T… 3’ A-C-C-T-C-A… 5‘ 核酸酶 单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶 基本特性：来自艾氏交替单胞菌（A.espejiana） Ca2+ 5‘ dNMPs 或 5‘ NMPs ssDNA or RNA Ca2+ Ca2+ 核酸酶 单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶 Bal31核酸酶的基本用途：诱发DNA突变 EcoRI A B C EcoRI EcoRI B C A Bal31 B C A 环化 A C 核酸修饰酶 末端脱氧核苷酰转移酶（TdT） TdT的基本特性：来自小牛胸腺,催化DNA在其3’-OH末端加NTP 不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs 5‘ p 3‘ HO OH 3‘ p 5‘ TdT Mg2+ dATP 5‘ p 3‘ HO AAAAAAAAAAAA OH 3‘ p 5‘ TdT的基本特性： 5‘ p 3‘ HO OH 3‘ p 5‘ TdT Co2+ dATP 5‘ p 3‘ HO AAAAAAAAAAA AAAAAAAAAA OH 3‘ p 5‘ 5‘ p 3‘ HO OH 3‘ p 5‘ TdT Co2+ dATP 5‘ p 3‘ HO AAAAAAAAAAAAAA OH 3‘ p 5‘ AAAAAAAAAAA 核酸修饰酶 碱性磷酸单酯酶 来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIP） 来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAP） 5‘ p OH 3‘ DNA or RNA 5‘ ppp dN 5‘ pppN BAP / CIP OH 3‘ 5‘ HO 5‘ HO dN 5‘ HO N 核酸修饰酶 T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP） T4-PNP的基本特性：在DNA、RNA的5‘-OH上加磷酸 5‘ HO 3‘ HO OH 3‘ OH 5‘ T4-PNP Mg2+ pppATP（g-32P-ATP） 5‘ p 3‘ HO OH 3‘ p 5‘ 用于探针的末端同位素标记： 3 基因工程的基本条件 各种基因工程受体的特性 实验室常用的基因工程受体 受体细胞应具备的条件 受体细胞应具备的条件 限制性缺陷型 外切酶和内切酶活性缺陷 重组整合缺陷型 用于基因扩增或高效表达的