四、基因工程工具酶.ppt

基因工程的工具酶（instrumental enzyme of gene engineering）是应用于基因工程各种酶的总称，包括核酸序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基因制取、重组体DNA制备等所需要的酶类。 核酸酶：能够将聚核苷酸链的磷酸二酯键切断的酶，属于水解酶。 核酸酶的分类： 1）根据核酸底物分RNA酶（Rnase）、DNA酶（Dnase）和底物非专一性核酸酶； 2）根据作用方式分内切核酸酶（endonuclease）和外切核酸酶（exonuclease）； 3) 根据对底物碱基专一性分碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列高度专一性）和非碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列随机性） 在限制修饰系统中，限制作用是指一定类型的细菌可以通过限制性核酸内切酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制； 而生物细胞(如宿主)自身DNA分子通过甲基化酶的作用，在碱基特定位置上发生了甲基化，可免遭自身限制性内切酶的破坏。 限制－修饰作用实际就是细菌中的限制性内切酶降解外源DNA ，维护自身遗传稳定的保护机制。  用于核酸操作的工具酶 回文结构（palindrome）：序列正读和反读是一样的，即有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方向读序列是完全一样的。 在切割位点处，限制性核酸内切酶的作用下磷酸二酯键会发生水解效应，从而导致链的断裂。 限制性核酸内切酶的切割类型： （1）两条链上的断裂位置是交错和对称围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘末端的DNA片段； （2）两条链上的断裂位置是处在一个对称轴的中心，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片段。 位点偏爱（site preference） 某些限制性内切酶对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率。 星号活性（star activity） 又称星活性，一些限制性内切酶在某些反应条件变化时酶的专一性发生改变，如酶浓度过高、反应液离子强度过低、pH改变、有机溶剂的影响等条件，酶切割位点专一性发生改变。 同裂酶 (isoschizomers) 有些来源不同的限制性核酸内切酶识别同样的核苷酸靶序列，产生同样的切割，形成同样的末端。 例如，XmaI（C CCGG G） SmaI（CCC GGG） 同尾酶? (isocaudamers) 来源不同，识别的靶序列也各不相同，但都能产生相同的粘性末端，称为同尾酶。常用的BamHⅠ，BclⅠ，BglⅡ，XhoⅠ就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由-GATC- 4个核苷酸组成的粘性末端。 影响限制性核酸内切酶活性的因素 DNA的分子结构 某些限制性核酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA的高出许多倍。 此外，还有一些核酸内切限制酶，切割它们自身处于不同部位的限制位点，其效率亦有明显的差别。 酶活性的正常发挥，是绝对需要二价阳离子，通常是Mg2+ 。 缓冲液Tris—HCl的作用在于使反应混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳数值范围之内。对绝大多数限制酶来说，在pH=7.5的条件下，其功能最佳。 巯基试剂对于保持某些内切酶的稳定性是有用的，但它同样也可能有利于潜在污染杂质的稳定性。 影响限制性核酸内切酶活性的因素 酶切消化反应的温度 大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是37℃，但也有许多例外的情况。 限制性内切酶反应的终止 消化DNA样品后，在进一步处理DNA样品前往往需要钝化内切酶的活性，钝化大多数限制性内切酶的方法是65℃温浴5分钟。但有些酶，如BamH I和HaeⅡ具备对热稳定性，则需加入终止反应液（加入0.5mol／L的EDTA使之在溶液中的终浓度达到10mmol/L 以螯合Mg2+）。 限制性核酸内切酶的特点 识别位点的DNA序列具有回文结构； 切割DNA均产生含5’磷酸和3’羟基的末端； 错位切割产生粘端，沿对称轴切割产生平末端； 限制性核酸内切酶的应用 在特异位点上切割DNA，产生特异的限制酶切片断； 用限制酶切割产生的相同粘末端以便重组； 建立DNA的限制酶切图谱； 构建基因组文库。 利用限制酶对DNA进行消化的具体步骤： 不同的限制酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件，甚至对同一种酶也如此，所以建议遵循与酶一