细胞培养第2次体外培养的基本方法和过程.ppt

二、体外培养的基本方法和过程 （2）分离（散）细胞培养物： 对于贴壁依赖型细胞来讲，随着培养时间的延长，细胞分裂增殖，数量愈来愈大，逐渐会在培养瓶皿的底壁形成一完整的细胞层，细胞之间因接触性抑制作用而停止生长，此时便需要进行传代。 判断分离（散）细胞培养物是否需要传代的主要指标就是观察培养物是否已基本长满培养瓶皿的底壁。 1、原代培养物需要传代的指标 （二）继代培养（secondary culture） 二、体外培养的基本方法和过程 （3）悬浮培养物： 悬浮培养细胞之间虽然不容易发生接触性抑制现象，但随着培养液中细胞数量的增加，细胞的生存空间会越来越小，营养供应愈趋紧张，代谢产物积聚，培养环境逐渐不适应细胞的生长，因而需要传代。 1、原代培养物需要传代的指标 （二）继代培养（secondary culture） 1、原代培养物需要传代的指标 2、传代的过程 3、传代培养的注意事项 二、体外培养的基本方法和过程 （二）继代培养（secondary culture） 二、体外培养的基本方法和过程 2、传代的过程 （1）分离（散）细胞培养物 ： （贴壁依赖型细胞） 1）弃去原培养液（吸出或倾倒） ； 2）漂洗：1~2次， 3）离解细胞： 4）终止消化： 5）吹打分离细胞： 6）离心： 7）重新悬浮、计数： 8）分装： 9）送培养箱继续培养。 （二）继代培养（secondary culture） （2）悬浮培养物：无需分割培养物。 1）离心： 2）重新悬浮、计数： 3）分装： 4）送培养箱继续培养。 二、体外培养的基本方法和过程 2、传代的过程 （二）继代培养（secondary culture） 二、体外培养的基本方法和过程 2、传代的过程 （3）植块培养物： 对这种培养物，仅在少数情况下再培养。 由于它们一般是种植在生长基质盖玻片上，再培养时一般不更换生长基质盖玻片，只是将培养物分割并舍弃部分培养物，而将剩余的培养物继续培养 （二）继代培养（secondary culture） 1、原代培养物需要传代的指标 2、传代的过程 3、传代培养的注意事项 二、体外培养的基本方法和过程 （二）继代培养（secondary culture） 二、体外培养的基本方法和过程 3、传代培养的注意事项 传代培养首先必须注意的事项： 根据不同细胞的承受能力； 选择合适的时间； 采用适当的方法。 （二）继代培养（secondary culture） 二、体外培养的基本方法和过程 3、传代培养的注意事项 （1）传代的时机与再培养的细胞密度： 不要急于传代是对大多数生命力较为脆弱的细胞体外培养的上策。 除非需要利用传代实现其它的目的，如通过传代对培养物中的混合细胞进行分离。 由于在体时细胞之间的相互作用有利于细胞的生存和生命活动，因而在进行体外分离细胞培养时尽量给细胞提供相互作用的条件。一个重要的方法就是增大接种的细胞密度，使培养的细胞尽快发生相互作用。 （二）继代培养（secondary culture） 二、体外培养的基本方法和过程 3、传代培养的注意事项 （2）传代数或代数与培养物的生长： 传代数或代数（passage number）是指对培养物传代的次数。用它可以相对地衡量某一培养物的培养年龄（culture age）。 经过一次传代，细胞的生长环境就发生一次大的变化。体外生长的细胞若处于“动荡”的生活环境中，其生物学性状往往容易发生改变，尤其是细胞的遗传特性可能会发生改变。 应该认识到，传代对细胞生长和性状是有影响的，在必要性不强的情况下，少传代为上。 （二）继代培养（secondary culture） （二）继代培养 （三）体外培养的基本方法和技术 （四）培养物的冻存与复苏 （五）培养物的污染 （一）原代培养 二、体外培养的基本方法和过程 二、体外培养的基本方法和过程 （三）体外培养的基本方法和技术 这里要介绍的是，体外培养这门技术从创立以来所发展起来的、若干种被普遍运用的、具有代表性的基本方法和技术。 这些基本的方法和技术有的还在使用，有的则已不常使用，代之以一些改良的方法和技术。 二、体外培养的基本方法和过程 （三）体外培养的基本方法和技术 1、悬滴培养法 2、培养瓶培养法 3、盖玻片培养法 4、旋转管培养法 5、灌注小室培养法 6、培养板培养法 7、二倍体细胞培养法 8、克隆培养法 9、中空纤维细胞培养技术 10、微载体细胞培养法 11、微囊培养技术 2、培养瓶（culture flask）培养法 凡是可以用于培养生物结构成分的瓶子都可以叫做培养瓶。 早期的培养瓶主要是玻璃培养瓶，如今国外主要用一次性使用的塑料培养瓶。 卡氏瓶（carlsbergs flask） 北京瓶 塑料培养瓶 所谓培养瓶培养法，就是将拟培养对象直