蛋白表达载体常用标签综述.pdf

蛋白表达载体系统 重组蛋白表达技术和重组蛋白表达载体现已广泛应用于生物学各个具体领域, 尤其是体内功能研究和蛋白质的大规模生产。 GeneCopoeia 的蛋白表达载体按照表达宿主的不同分为3 类:B 类，M 类和Lv 类。B 类的表达宿主为大肠杆菌，M 类的宿主为哺乳动物细胞，Lv 类是慢病毒载 体，宿主可以为哺乳动物细胞或原代细胞。 除了必要的复制和筛选的元件，协助表达和翻译的元件外，本文将各类载体按 荧光蛋白标签、多功能标签、促溶解度标签和抗体免疫共沉淀标签四种，先将几 种主流的标签功能初步介绍如下： eGFP/eCFP/eYFP/mCherry 分别是增强型绿色荧光蛋白/增强型黄绿色荧光蛋白/增强型黄色荧光蛋白/单 体红色荧光蛋白标签,具有不同的激发波长和发射波长，均由野生型荧光蛋白通 过氨基酸突变和密码子优化而来。就eGFP 而言，相对于GFP，其荧光强度更强、 荧光性质更稳定。同时载体中构建的Kozak 序列使得含有eGFP 的融合蛋白在真 核表达系统中表达效率更高。mCherry 是从DsRed 演化来的性能最好的一个单体 红色荧光蛋白，可以和GFP 系列荧光蛋白共用，实现多色标记体内、外实验表明， mCherry 在N 端和C 端融合外源蛋白时，荧光蛋白活性和被融合的目标蛋白功能 相互没有明显影响。 这些荧光标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： 1.不用破碎组织细胞、不加任何底物，直接通过荧光显微镜就能在活细胞中发出 绿色荧光，实时显示目的基因的表达情况，而且荧光性质稳定，被誉为活细胞探 针。 2.其自发荧光，不需用目的基因的抗体或原位杂交技术就可推知目的基因在细胞 中的定位等情况。 3.同时细胞内的其它产物不会干扰标签蛋白检测，从而使其检测效果更快速、简 便、灵敏度高而且重现性好。 4.其低消耗、高灵敏度检测的特性，十分适用于高通量的药物筛选。现eGFP 表 达标签被广泛地应用于基团表达调控、转基因功能研究、蛋白在细胞中的功能定 位、迁移变化及药物筛选等方面。 5.mCherry 红色荧光蛋白在标记病毒颗粒，研究病毒和宿主细胞之间更有得天独 厚的优势。如用mRFP 或mCherry 标记HIV 病毒颗粒，研究H1V 和宿主细胞问的 相互作用以及HIV 侵染宿主细胞的过程．用mRFP 标记慢病毒颗粒，研究慢病毒 在小鼠体内的复制过程等。 荧光素酶 来源于生物体内的荧光素，常见的有萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶和Guassia 荧光素酶。这些荧光素酶作为“报告蛋白”被用于分子生物学研究中，这种技术被 称为报告基因检测法或萤光素酶检测法（Luciferase Assay）。跟普通融合蛋白 标签不同，使用荧光素酶构建的报告基因可用作目的基因的定量分析。因此常用 于研究启动子、miRNA 3UTR 克隆的功能与调控，因为它们对目的基因的调控 可以是渐变的，而不是简单的开和关两种状态。 优点：灵敏度高，检测幅度宽；不是哺乳动物细胞内源性基因；重复性好；与 HTS 兼容等。萤火虫和海肾荧光素酶已经被广泛应用于协同报告并进行均一化研 究。由于它们都是快速，容易和高灵敏的监测方法。而且萤火虫和海肾荧光素酶 是理想的双基因报告系统，因为它们来源于不同的生物进化方向，蛋白结构和底 物差异都很大，在实验中不会产生相互影响。 基于荧光素酶的特性，我司研发提供的Secrete-Pair™ Dual Luminescence Assay Kit 可用于分析双报告系统中Gaussia 荧光素酶（GLuc ）和分泌型碱性磷酸酶 (SEAP)活性。GLuc 和SEAP 均为分泌型报告蛋白，无需裂解细胞即可便捷地从 细胞培养液中取得样本，并对实验结果进行精准的实时分析。 SNAP-Tag SNAP-Tag 是新一代的蛋白标签技术，不仅专一性极高而且稳定，最大的优点 是适用于多种环境下的蛋白质检测与纯化，如活细胞内、溶液中、或固态相(如 SDSgels)等。 SNAP-Tag 是从人的O6-甲基鸟嘌呤-DNA 甲基转移 （O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase）获得。无论体内还是体外，SNAP-Tag 都能与底物高特异性地共价结合，使蛋白标记上生物素或荧光基团（如荧光素和 若丹明）。SNAP 所带的活性巯基位点接受了苯甲基鸟嘌呤所携带的侧链苯甲基 基团，释放出了鸟嘌呤。这种新的硫醚键共价结合使SNAP 所带的目的蛋白携带 上了苯甲基基团所带的标记物。苯甲基鸟嘌呤在生化条件下稳定，并且没有其他 蛋白