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植物生理学 实验3_NR活性测定.ppt

发布:2019-04-14约1.82千字共16页下载文档
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实验二 问题分析 气孔密度 (单位):固定法比印迹法多 气孔大小(开度):Na+可以代替K+,但效果较差 取样时间、位置及照光时间 实验三 硝酸盐和光诱导对硝酸还原酶活性的影响 硝酸盐还原 硝酸盐的还原由硝酸还原酶(nitrate reductase)催化。硝酸还原酶存在于细胞液中,为一种诱导酶。 诱导酶(induced enzyme) 植物体本来不含有,但在特定的外来物质(如底物)的影响下诱导形成的酶 NO3-的还原在根或叶中均可进行 NO3-供应少时,主要在根中还原 NO3-供应量大而根中还原力不足时, NO3-运到叶片进行还原 亚硝酸盐还原为氨 亚硝酸还原或在根中的前质体,或在叶中的叶绿体中进行。 还原所需的电子来自还原态的铁氧还蛋白。 NO3-还原为NO2-后,NO2-被迅速运进质体即根中的前质体或叶中的叶绿体,并进一步被亚硝酸还原酶(NiR)还原为NH3或NH4+。 一 实验目的 理解硝酸还原酶的特性; 掌握硝酸还原酶活性测定方法。 实验原理 在一定条件下,NO2-的生成量与硝酸还原酶活性呈正相关。 NO2-含量的测定用磺胺比色法。在酸性溶液中磺胺与NO2-形成重氮盐,再与α-萘胺偶联形成红色的偶氮化合物,可用分光光度计在540nm下比色测定。 三 材料与方法 两种处理的小麦材料[水(W), KNO3 (N)] A液 磷酸缓冲液:水:DNP溶液:蔗糖溶液= 5:5:1:1 B液 磷酸缓冲液:KNO3:DNP溶液:蔗糖溶液= 5:5:1:1 磺胺试剂 α-萘胺试剂 四 实验步骤 两种材料[水(W), KNO3 (N)]各取2份新鲜叶片中段,用蒸馏水洗净、擦干,剪成0.5 cm小段,各称取0.3克两份; 将两份(W、N)叶段分别置于含有10 ml A、B溶液的两只试管中,即WA、WB, NA、NB四管(每个试管塞蓝色纱网); 将试管放在真空干燥器中抽气0.5h,放气后摇晃直至叶段沉于溶液中; 将试管置于25-30℃温箱中黑暗保温0.5h; 取四支试管,标号为WA′、WB ′ , NA ′ 、NB ′,分别吸取1ml对应反应液,各加入2ml磺胺试剂和2mlα-萘胺试剂(注意顺序),混合摇匀, 25℃水浴5min,取出室温静置25min。 再取两支试管分别取A液或B液1ml代替反应液,各加入2ml磺胺试剂和2mlα-萘胺试剂。设空白对照管在540 nm测定吸光值。 表 硝酸还原酶的活性 六 思考题 为何提前一天施KNO3,并且取样应在晴天进行? 七 注意事项 摇晃直至叶段沉于溶液中(试管内放入滤网) 磺胺试剂和 α-萘胺试剂(加入时注意顺序) 加入磺胺和α-萘胺后要混合摇匀,静置30分钟 分光光度计使用 (测定之前注意波长) * * NR基因表达的调控 实验证明NO3-能诱导NR的表达 叶绿体 叶绿体中,还原反应所需的一对电子由还原态铁氧还蛋白提供 NR是诱导酶,在取样前一天用50mM KNO3- 或NaNO3-加到培养苗的水中以诱导硝酸还原酶的产生。 NO2-产生 NO3- +NADH+ + H+→ NO2- +NAD++H2O 外界溶液中的NO3-渗入植物组织后,经硝酸还原酶作用,所产生的NO2-可以从组织内渗透到外界溶液中; 测定反应溶液中NO2- 含量的增加,即表现该酶活性的大小。 NH2 NO2-含量测定 NO2-含量测定 当磺胺与α-萘胺均过量时,所生成的红色深浅与NO2-含量成直线关系。 NO2-含量标准曲线: [ NO2- ] (μ Mol / ml)= 0.0026+0.359OD540 硝酸还原酶活性测定 NR酶活性( NO2- μMol/h?gfw)= [ NO2- ] ×10ml/1ml÷(鲜重g×0.5h) H2O KNO3 处 理 A 液 B 液 吸光度 吸光度 ODB-ODA NR活性 结果记录、计算 [ NO2- ] (μmol/ml)= 0.0026+0.359OD540 酶活性( NO2- μmol/h?gfw)= [ NO2- ] ×10ml/1ml÷(鲜重g×时间h)
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