实验4-ELISA双抗体夹心法检测癌胚抗原.pptx

INSTITUTE FOR IMMUNOBIOLOGYDEPARTMENT OF IMMUNOLOGYDEPARTMENT OF IMMUNOLOGY实验三ELISA双抗体夹心法检测癌胚抗原复旦大学免疫学系 李春晓E-mail: cxli14@酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)是以免疫学反应为基础，将抗原与抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的实验技术。ELISA的原理★使单克隆抗体（一抗）结合到某种固相载体（聚苯乙烯）表面，并保持其免疫活性；★使生物素抗体（二抗）与某种酶连接成酶标抗体，这种酶标抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性；固相载体酶标抗体/抗原①②★测定时，把标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗体按不同的步骤与固相载体表面的单克隆抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例；★加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析(酶标仪)；★由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。酶★用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。★常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。★ ELISA法中所用的酶要求纯度高，催化反应的转化率高，转一性强，性质稳定，继续保留它的活性部位和催化能力。ELISA的类型 ★双抗体夹心法 ★竞争法★间接法测抗体等双抗体夹心法：检测抗原最常用的方法双抗体夹心法：检测抗原最常用的方法癌胚抗原CEA(1) CEA最初发现于结肠癌和胎儿肠组织中，故名癌胚抗原。CEA升高常见于大肠癌、/doc/2684807.html胰腺癌、胃癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌等。但吸烟、/doc/4802246.html妊娠期和/doc/6119824.html心血管疾病、糖尿病、非特异性结肠炎等疾病，15%～53%的病人血清CEA也会升高，所以CEA不是恶性肿瘤的特异性标志，在诊断上只有辅助价值。(2) 癌胚抗原（CEA）是一种存在于结肠癌、正常胚胎肠道、胰腺和肝内的一种蛋白多糖复合物。若与CEA升高有关的肿瘤切除后，观察CEA水平可用于该肿瘤复发的检测。 (3) 97%的健康成人血清CEA浓度在2.5ng/mL以下。实验材料待测样品1、样品2酶结合物、CEA酶标准品、微孔反应板（包被有CEA单抗）洗涤液底物显色液A(含过氧化氢)、底物显色液B(含TMB) 、终止液加样枪吸水纸、废液缸37℃孵箱TMB，即3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine，是辣根过氧化物酶的常用底物。在辣根过氧化物酶或其他适当过氧化物酶的催化下，TMB会产生可溶性蓝色产物。蓝色操作步骤（1）加样：依次加入6个标准品（0、5、10、20、40、80ng/ml）、样品1、样品2，每孔100ul，混匀；（2）温育：37℃，30分钟；（3）洗板：弃去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置10秒，甩干，重复4次后，拍干；（4）加酶：加入酶标抗体，每孔100ul，混匀；（5）温育：37℃，30分钟；（6）洗板：同步骤3（7）显色：加入显色剂A、B，每孔各一滴，混匀，37℃，15分钟；（8）终止：加入终止液，每孔一滴；（9）测定：30分钟内用酶标仪单波长450nm测定各孔OD值。结果判断1.定性实验显色反应后，液体变为黄褐色则为阳性2.定量实验在450nm波长处于酶标测定仪上测定每孔OD值1.绘制剂量反应曲线：依据CEA标准品含量及其OD值绘制标准曲线。待测样品CEA含量可根据标准曲线计算得到。2.结果判定：测定标本CEA含量≥5ng/ml时为癌胚抗原阳性。测定标本CEA含量5ng/ml时为癌胚抗原阴性。注意事项操作前将试剂在室温下平衡30-60分钟.加样后及时放入孵箱，标本较多时，请分批操作。按说明步骤严格控制操作时间。洗板时保证洗液注满各孔，洗完板后最好在吸水纸（选择干净、无或少尘的吸水材料）上轻轻拍干； 加样时保持显色剂不外流； 在加终止液时应避免产生气泡。TMB，即3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine，是辣根过氧化物酶的常用底物。在辣根过氧化物酶或其他适当过氧化物酶的催化下，TMB会产生可溶性蓝色产物。蓝色产物通常可以在370nm或620-650nm测定吸光度。