ELISA双抗夹心法检测抗原20110720123752.ppt

HRP的色原底物系统 与HRP反应后的颜色 加终止液后的颜色 读数波长 特 点 OPD 临苯二胺 492nm 致畸， 但本底好 TMB 四甲基联苯胺 450nm 操作方便， 本底较高 ELISA 数据的处理 根据standard的浓度和对应的OD值计算出线性方程 将所测定样品的OD值代入方程计算出相应的样品的浓度 Protocal 包被：用Coating buffer 1:1000稀释Capture Ab ，100ul/孔，湿盒4℃过夜； 洗板：弃去孔内液体，PBST洗涤，3×3min，控干； 封闭：加1×Assay diluent 200ul/孔，37℃避光孵育2h； 洗板：弃去孔内液体，PBST洗涤，4×3min，控干； 5. 加样：100ul/孔，37℃避光孵育1h ； 6. 洗板：弃去孔内液体，PBST洗涤，4×3min，控干； 7. Biotin-Detection Ab: 用1×Assay diluent 1:1000 稀释detection Ab ，100ul/孔， 37℃避光孵育1h； 8. 洗板：弃去孔内液体，PBST洗涤，4×3min，控干； 9. Avidin-HRP: 用1×Assay diluent 1:250稀释AV-HRP ，100ul/孔， 37℃避光孵育45min； 10. 洗板：弃去孔内液体，PBST洗涤，5×3min，控干； 11. 显色：1×TMB solution，100ul/孔，37℃孵育1-30min； 12. 终止反应：显色完全后加 2M H2SO4 50ul/孔，终止显色反应； 于450nm处读取光密度OD值或吸光度A值； 13. 绘制标准曲线，分析数据 2.洗涤 次日，弃去孔内液体，用0.05%PBST洗板3次（将PBST加入每孔，静置3min 后倾去），控干，洗去游离抗体。 湿盒中，4℃过夜 酶标板 1.包被 (Note PBST洗涤液:0.05% Tween-20 -PH 7.4 1×PBS) 1×Coating buffer 1:1000稀释Capture Ab ， 100μl/孔加入到酶标板中，封口膜(或保鲜膜等）封闭酶标板后，放入湿盒中，4℃过夜。 1×Assay diluent， 200μl/孔加入到酶标板中，封口膜封闭酶标板后，放入湿盒中，37℃避光孵育2h。 4.洗涤 弃去孔内液体，用0.05%PBST洗板4次，（将PBST加入每孔，静置3min 后倾去）；控干； 37℃避光孵育2h 3.封闭 （Note 1×Assay diluent：用纯水将5×Assay diluent 稀释至1×） 以上助教老师负责完成 5. 加样----抗原与抗体孵育 1）制作标准曲线： 1×Assay diluent 倍比稀释standard，每个梯度各取100μl加入酶标板，做复孔； 2）待测样品：取100μl待测样品加入酶标板，做复孔； 3）空白对照：取100μl 1×Assay diluent加入酶标板，做复孔； 37℃避光孵育1h 50ul Standard 原液 ? ? 1/8 1/16 1/32 待测抗原 100μl 空白对照 阳性对照 每组4位同学的加样顺序： 待测抗原 100μl 待测抗原 100μl 样本有4种，每人选一种做复孔 每组做阳参2个孔 每组做空白对照2个孔（加样1×Assay buffer） 每孔加样100μl 待测抗原 100μl 6. 洗板：弃去孔内液体，PBST洗涤，4×3min，控干； 7.Biotin-Detection Ab: 用1×Assay diluent 1:1000稀释detection Ab ，100μl/孔，37℃避光孵育1h； 8. 洗板：弃去孔内液体，PBST洗涤，4×3min，控干； 9. Avidin-HRP(HRP见光分解，之后所有步骤避光操作） 用1×Assay diluent 1:250稀释AV-HRP ，100μl/孔， 37℃避光孵育45min； 10. 洗板：弃去孔内液体，PBST洗涤，5×3min，控干； 11. 显色： 1×TMB solution，100μl/孔，37℃孵育1-30min； 12. 终止反应： 显色完全后加 2M H2SO4 50μl/孔，终止显色反应;450nm处读取光密度0D值（或者吸光度A值） 13. 绘制标准曲线，分析数据 结果判断 定性实验 　显色反应后，如液体颜色变成蓝色则为阳性；仍为无色液体，则待测样品为阴性 定量