完整版ELISA双抗夹心法检测抗原.ppt

HRP的色原底物系统 与HRP反应后的颜色 加终止液后的颜色 读数波长 特 点 OPD 临苯二胺 492nm 致畸， 但本底好 TMB 四甲基联苯胺 450nm 操作方便， 本底较高 最新.课件 * ELISA 数据的处理 根据standard的浓度和对应的OD值计算出线性方程 将所测定样品的OD值代入方程计算出相应的样品的浓度 最新.课件 * Protocal 包被：用Coating buffer 1:1000稀释Capture Ab ，100ul/孔，湿盒4℃过夜； 洗板：弃去孔内液体，PBST洗涤，3×3min，控干； 封闭：加1×Assay diluent 200ul/孔，37℃避光孵育2h； 洗板：弃去孔内液体，PBST洗涤，4×3min，控干； 5. 加样：100ul/孔，37℃避光孵育1h ； 6. 洗板：弃去孔内液体，PBST洗涤，4×3min，控干； 7. Biotin-Detection Ab: 用1×Assay diluent 1:1000 稀释detection Ab ，100ul/孔， 37℃避光孵育1h； 8. 洗板：弃去孔内液体，PBST洗涤，4×3min，控干； 9. Avidin-HRP: 用1×Assay diluent 1:250稀释AV-HRP ，100ul/孔， 37℃避光孵育45min； 10. 洗板：弃去孔内液体，PBST洗涤，5×3min，控干； 11. 显色：1×TMB solution，100ul/孔，37℃孵育1-30min； 12. 终止反应：显色完全后加 2M H2SO4 50ul/孔，终止显色反应； 于450nm处读取光密度OD值或吸光度A值； 13. 绘制标准曲线，分析数据 最新.课件 * ELISA 双抗体夹心法检测抗原 王春 复旦大学免疫学系 复旦大学免疫生物学研究所 细胞与分子免疫学技术 最新.课件 * 酶联免疫吸附实验 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ，ELISA) 一种固相酶免疫测定技术，利用酶标记的抗原或者抗体，在固相载体上定量或定性测定特异性抗体、可溶性抗原及细胞表面抗原。 1971年由瑞典学者Engrall和Perlmann,荷兰学者weeman和Schuurs报道； 开创了运用酶标记免疫技术进行液体标本中微量物质测定的实验方法； 最新.课件 * ELISA-测抗原（Ag）或抗体（Ab）三要素 抗原或抗体的固相化：已知的Ag/Ab结合到固相载体表面，并保持其免疫活性； 抗原或抗体的酶标记：酶标Ag/Ab,并保持其免疫活性和酶活性； 底物显色：底物被酶催化成为有色产物—定性和定量– 放大免疫反应的信号 基本原理 最新.课件 * 高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性 高灵敏度：酶催化底物显色的高效性， pg水平微量检测 定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值 基本特点 最新.课件 * 基本类型 抗体测定法 间接法检测特异性抗体 抗原测定法 直接竞争法检测可溶性抗原 双抗体夹心法检测可溶性抗原 （改良双抗体夹心法检测可溶性抗原） 应用生物素-亲和素双抗体夹心ELISA法 最新.课件 * 基本类型 抗体测定法 间接法检测特异性抗体 抗原测定法 直接竞争法检测可溶性抗原 双抗体夹心法检测可溶性抗原 （改良双抗体夹心法检测可溶性抗原） 应用生物素-亲和素双抗体夹心ELISA法 最新.课件 * 显色 间接法检测特异性抗体 包被已知抗原 与待测抗体孵育 与酶标抗体孵育 加入底物 包被已知抗原 最新.课件 * 优点: 只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法 操作简单迅捷 缺点： 可重复性差 通常用于抗体效价的检测和某些疾病的早期诊断 最新.课件 * 基本类型 抗体测定法 间接法检测特异性抗体 抗原测定法 直接竞争法检测可溶性抗原 双抗体夹心法检测可溶性抗原 （改良双抗体夹心法检测可溶性抗原） 应用生物素-亲和素双抗体夹心ELISA法 最新.课件 * 直接竞争法检测可溶性抗原 原理：待检抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合；待检抗原含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。 最新.课件 * 优点： 待检抗原只需要一个抗原决定簇，适合小分子抗原，如，激素，药物等； 操作步骤简单快捷，只需要一个保温洗涤过程 缺点： 酶标记抗体用量大； 定量检测的灵敏度和重复性存在不足。 最新.课件 * 基本类型 抗体