重组慢病毒介导超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道4 基因转染BMSCs 的实验研究.pdf

1512 Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, December 2013, Vol. 27, No.12 · · 重组慢病毒介导超极化激活的环核苷酸门控阳离子 4 BMSCs 通道 基因转染 的实验研究 于风旭 方易冰 刘炫 赖前成 贾建博 廖斌 【摘  要】    目的  探讨重组慢病毒（lentivirus ，LVs ）介导超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道4 （hyperpo- larization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel 4 ，HCN4 ）基因转染大鼠BMSCs 构建生物起搏细胞的可行性。  方 法  选取3 ～5 周龄SD 大鼠，采用改良全骨髓贴壁培养法分离培养BMSCs 。以LVs 作为转染载体，增强绿色荧光蛋 白（enhanced green fluorescent protein，EGFP ）为标记，构建LVs-HCN4-EGFP 病毒液。取第3 代BMSCs 分别转染LVs- HCN4-EGFP 病毒液（实验组）和LVs-EGFP 空白病毒液（对照组），荧光显微镜观察转染24 、48 、72 h 后两组绿色荧光表 达情况，72 h 时Western blot 检测HCN4 蛋白表达；电生理检测实验组转染72 h 后BMSCs 的起搏电流。  结果  实验 组BMSCs 形态正常、生长良好；48 h 后荧光显微镜下可见散在的绿色荧光，转染效率约 10%；72 h 荧光表达稍增多，转 染效率为20% ～25% 。对照组未见绿色荧光表达。Western blot 检测示转染72 h 后，实验组可见与HCN4 蛋白相对分 子质量相同的条带表达，而对照组仅有微弱表达；实验组蛋白条带灰度值为33.75 ± 0.41，显著高于对照组的23.39 ± 0.33 （t=17.524 ，P=0.013 ）。实验组转染后的BMSCs 检测到起搏电流，并能被CsCl 完全阻断，符合起搏电流特点。  结论  重 组LVs 介导HCN4 基因成功转染大鼠BMSCs ，并检测到HCN4 蛋白表达及起搏电流。 【关键词】    超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道4 BMSCs    慢病毒转染    起搏电流 EXPERIMENTAL RESEARCH OF RECOMBINANT LENTIVIRUS MEDIATED HYPERPOLARIZATION-ACTIVATED CYCLIC NUCLEOTIDE-GATED CATION CHANNEL 4 GENE TRANSFECTING BONE MESENCHYMAL STEM CELLS/YU Fengxu, FANG Yibing, LIU Xuan, LAI Qiancheng, JIA Jianbo, LIAO Bin. Department of Cardiothoracic Surgery, the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou Sichuan, 646000, P.R.China. Corresponding author: LIAO Bin, E-mail: liaobindr@ 【Abstract 】 Objective To investigate the feasibil ity of recombinant lentivirus (LVs) mediated hyperpolarization- activated cyclic nucleotide-gated cation channel 4 (HCN4) gene transfecting rat bone m