生物大分子物质的制备.ppt

三、化学处理脂溶性的溶剂可把细胞壁、细胞膜的结构部分溶解四、生物酶降解生物酶(如溶菌酶)有降解细菌细胞壁的功能。在用此法处理细菌细胞时，先是细胞壁消解，随之而来的是因渗透压差引起的细胞膜破裂，最后导致细胞完全破碎。第31页,共61页，2024年2月25日，星期天第四节抽提一、抽提的含义抽提通常是指用适当的溶剂和方法，从原料中把有效成分分离出来的过程。经过处理和破细胞原材料中的有效成分可用缓冲液、稀酸、稀碱、或有机溶剂(如丙酮、乙醇)等抽提；还可用蒸馏水抽提。第32页,共61页，2024年2月25日，星期天一般理想的抽提溶液应具备下述条件：对有效成分溶解度大，破坏作用小；对杂质不溶解或溶解度很小；来源广泛、价格低廉、操作安全等。第33页,共61页，2024年2月25日，星期天二、抽提有效成分的影响因子抽提时pH值、金属离子、溶剂的浓度、极性等因子，可明显影响有效成分的性质和数量。第34页,共61页，2024年2月25日，星期天1pH值对蛋白质或酶等具有等电点的两性电解质物质，一般选择抽提液的pH值应在偏离等电点的稳定范围内。通常：抽提碱性蛋白质选用低pH值的溶液；抽提酸性蛋白质选用高pH值的溶液；或者用调至一定pH值的有机溶剂。第35页,共61页，2024年2月25日，星期天2溶剂的极性和离子强度有些蛋白质或酶在极性大、离子强度高的溶液中稳定；有些则在极性小、离子强度低的溶液中稳定。（1）通常降低极性的方法在水溶液中增加蔗糖或甘油的浓度。若用二甲基亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺代替蔗糖或甘油时，会使溶液的极性大大降低。（2）离子强度等于溶液中各离子浓度（C）与离子电荷数（Z）平方乘积总和的二分之一。在水溶液中加人中性盐如KCl、NaCl、NH4Cl和(NH4)2SO4能提高溶液的离子强度。一般来说：离子强度较低的中性盐溶液有促进蛋白质溶解，保护蛋白质活性的作用；离子强度过高则会引起蛋白质发生盐析作用。第36页,共61页，2024年2月25日，星期天3水解酶在抽提、纯化蛋白质或核酸时，其效果常常受到本身存在的水解酶的影响。这些酶在与欲抽提的蛋白质或核酸接触时，一旦条件适宜，就会发生反应，导致蛋白质或核酸分解，而使实验失败。防止方法（目的是使这些酶丧失活性）：①加入抑制剂(苯甲基磺酰氟化物，PMSF，见表1-1、1-2)，②调节抽提液的pH、离子浓度或极性等方法，第37页,共61页，2024年2月25日，星期天4温度一般认为蛋白质或酶制品在低温(如0℃左右)时最稳定。但有些物质对温度的要求却与此不同。例如：从鸟肝分离出的丙酮酸羧化酶对低温敏感，25℃时才稳定。有机磷农药水解酶，置-10℃时会快速失活，移至21℃时两天后开始失活，此后每天失活剩余酶的16％。若将其存放在6℃时失活速度较缓慢，每天约丧失活力0.75％。第38页,共61页，2024年2月25日，星期天5搅拌搅拌可促使欲抽提物与抽提液之间相互接触，并能增加溶解度。但是，一般宜采用温和的搅拌方法，速度太快时容易产生泡沫，导致某些酶类变性失活。6氧化存在氧化剂或氧分子时，会使巯基形成分子内或分子间的二硫键，导致酶(或蛋白质)失活(或变性)。在抽提液中加入还原剂时，就可以防止巯基发生氧化作用，或者延缓某些酶活性的丧失。在有些植物组织或微生物细胞中含有较多的酚类化合物，加入还原剂可防止褐化。第39页,共61页，2024年2月25日，星期天7金属离子蛋白质的巯基能和金属离子如铅、铁或铜作用，产生沉淀复合物。这些金属离子主要来源于制备缓冲液的试剂中。解决的办法:①用无离子水或重蒸水配制试剂；②在配制的试剂中加入1-3mmol／LEDTA(金属离子络合剂)。8抽提液与抽提物的比例在抽提时，抽提液与抽提物的比例一般以5︰1为宜。如抽提液过多，则有利于有效成分的提取，但不利于纯化工序的进行。否则反之。第40页,共61页，2024年2月25日，星期天第五节浓缩一般抽提液的体积都比较大，应先进行浓缩处理。常用的浓缩方法有下面几种:沉淀法吸附法超过滤法透析法减压蒸馏法冰冻干