实验六三过氧化氢酶活性的测定.ppt

蛋白质的性质和分离、纯化　 1、蛋白质的酸碱性质 等电点 与它所含的酸碱氨基酸数目比例有关 等离子点 蛋白质的一个特征常数 2蛋白质的胶体性质 维持蛋白质胶体性质稳定的因素（3点） 3蛋白质沉淀的方法 等电点沉淀法（ 可逆、不变性)盐析法 （可逆、不变性） 有机溶剂沉淀法（ 可逆或不可逆） 重金属盐沉淀法 （变性） 生物碱试剂 （变性）加热沉淀法（ 变性） 强酸碱沉淀（不可逆） 4蛋白质的变性与复性（温和条件、变性因素、常用变性剂） 蛋白质相对分子质量的测定　　 根据分子大小不同的方法 透析和超过滤 利用溶解度差别的纯化方法（实践最常用的方法a盐析b有机溶剂分级分离） 根据电荷不同的纯化方法 （PAGE、醋酸纤维素薄膜电泳、离子交换层析） 利用选择性吸附的纯化方法 利用对配体的特异生物学亲和层析: 一步处理即 亲和力的纯化方法可分离所需蛋白质，纯度很高 （一）蛋白质的含量测定 ①凯氏定氮法 ②双缩尿法 ③ Folin-酚试剂法 ④紫外吸收法 ⑤考马斯亮蓝结合法灵敏度高，重复好 ⑥胶体金测定法 灵敏度最高 （二）蛋白质的纯度测定 电泳、沉降、HPLC和溶解度分析等。 植物细胞DNA提取的方法 CTAB法提取植物组织DNA SDS法提取植物组织DNA 以螯合树脂、特异性 DNA 吸附膜、离子交换纯化柱及磁珠或玻璃粉吸附等基础 DNA 提取新方法 植物RNA的 提取方法 CTAB法、SDS法、快速SDS法、异硫氰酸胍法、Tris-硼酸法和Trizol一步法胍法、苯酚法和十六烷基三甲基溴化胺法等 电泳图 实 验 三 过氧化氢酶活性的测定——碘量法 生物体内重要的三种氧化酶类，其作用均是清除体内自由基： POD：过氧化物酶 SOD：超氧化物歧化酶 CAT：过氧化氢酶 一、实验目的： 1、掌握碘量法测定过氧化氢酶活性的原理和方法； 2、了解过氧化氢酶的作用。 二、实验原理: 植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积。H2O2可进一步生成氢氧自由基（OH˙）。 氢氧自由基（OH˙）是化学性质最活泼的活性氧，可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并且有非常高的速度常数，破坏性极强，可使细胞膜遭受损害，加速细胞的衰老和解体。 过氧化氢酶(catalase；CAT)可以清除H2O2、分解氢氧自由基，保护机体细胞稳定的内环境及细胞的正常生活，因此CAT是植物体内重要的酶促防御系统之一，其活性高低与植物的抗逆性密切相关。 二、实验原理: CAT活性大小以一定时间内分解的H2O2量来表示：在一定条件下，CAT能把H2O2分解为H2O和O2。当CAT与H2O2反应一定时间(t)后，再用碘量法测定未分解的H2O2，以钼酸铵作催化剂，H2O2与KI反应，释放出游离碘，然后用硫代硫酸钠滴定碘，反应式为：H2O2（余）+2KI+H2SO4→I2+K2SO4+2H2OI2 +2Na2S2O3 --→2NaI+Na2S4O6（连二硫酸钠）用硫代硫酸钠分别滴定空白液(可求出总的H2O2量)和反应液(可求出未分解的H2O2量)，再根据二者滴定值之差求出分解的H2O2量。 三、实验材料、仪器和试剂： 1、实验材料：三叶草 2、仪器： (1) 滴定管 (2)研钵 (3) 容量瓶(4)移液管 (5)三角瓶(100ml) 3、试剂： （1）0.05M H2O2（2）0.2M Na2S2O3 （3）1.8M H2SO4（4）1.5%淀粉溶液 （5）10%（NH4)6Mo7O24 （6）20% KI （7）石英砂 四、实验步骤： 1、酶液提取：称取0.5g三叶草，加少量石英砂，2ml水，研成匀浆，移入25ml容量瓶，冲洗研钵数次，定容，静置，过滤。 2、酶促反应： （1）取锥形瓶2个，编号A，B，各加入10ml酶液，之后立即向A瓶中加入1.8mol/L H2SO45ml，终止酶活性，作空白滴定。 （2）向A，B两瓶各加H2O2 5ml，摇匀，在加入B瓶那一刻起，记录 时间，5分钟后迅速向B瓶中加入1.8mol/LH2SO45ml，终止酶活性。 3、滴定：向A，B两瓶各加1ml 20% KI和3滴（NH4）6Mo7O24，摇匀后迅速加入5滴1.5%淀粉溶液，用Na2S2O3进行滴定至蓝色恰好消失，记录两次消耗Na2S2O3的体积VA(空白)，VB(反应液)。 酶活性测定 五、实验结果与计算： 1、被分解的H2O2量（mg） = （空白滴定值-样品滴定值）×Na2S2O3摩尔浓度×17 2、CAT活性（mg.g-1.min-1）=被分解的H2O2量（mg）×(总体积÷测定取液量)样品重（g）×时间（min） * Plea