过氧化氢酶CAT活性测定.doc

过氧化氢酶活性测定------------紫外吸收法 过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。 一、原理】 H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。 【仪器与设备与试剂】 1、材料 小麦叶片等。 2、仪器设备 研钵；离心机；250ml容量瓶；移液管（0.5ml、2ml各2支）；10ml试管3支；恒温水浴；紫外分光光度计； 3、试剂 0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）； 0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。 【方法】 1.酶液提取： 藻液接种后每隔1d，取40ml藻液（取时需摇匀），于4℃，于8 500 r/min（10 000g）下离心10min收集藻体，用0.1mol/L 、pH7.8磷酸钠缓冲液3mL重悬浮，然后用冰浴超声破碎细胞，破碎液在4℃下10200 r/min离心10min,上清液即为SOD和CAT粗酶液。 酶活性测定 取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表2-14-1顺序加入试剂。 表2-14-1 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表 管 号 S1 S2 S3 管号 S0 S1 S2 粗酶液(ml) 0.2 0.2 0.2 蒸馏水/ml 1.0 1.0 1.0 pH7.8磷酸(ml) 1.5 1.5 1.5 将S0号管在沸水浴煮1min以杀死酶液，冷却。然后将所有试管在25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色皿中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。 3.结果计算： 以每分钟A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（U）。 过氧化氢酶活性U/(g.min)= A240= AS0－ 式中 AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值； AS1, AS2—样品管吸光值； Vt—粗酶提取液总体积（ml）； V1—测定用粗酶液体积（ml）； FW—样品鲜重（g）； 0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）； t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。 【注】 所用H2O2溶液及KMnO4一溶液临用前需重新标定。 【注意事项】 凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。 ???