生物化学（王金福）BB[01].ppt

* * Hb: * 5、凝胶过滤法测定相对分子质量 通过凝胶过滤可以把蛋白质混合物按分子的大小分离开来。 蛋白质分子通过凝胶柱的速度并不直接取决于分子的质量，而是它的斯托克半径。 某种蛋白质如果与一理想的非水化球体具有相同的过柱速度，则认为这种蛋白质具有与此球体相同的半径，称蛋白质分子的斯托克半径。 测定方法： 首先侧得几种相对分子质量已知的蛋白质标准物的过柱速度，并以其相对分子质量的对数与过柱速度作标准直线图，然后测出蛋白质样品的过柱速度，即可从标准直线图中确定样品的相对分子质量。 5、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量 蛋白质颗粒在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，其迁移率决定于其所带的净电荷、分子大小和形状等。 如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）和巯基乙醇，则蛋白质迁移率主要取决于其相对分子质量，而与原来所带的电荷和分子形状无关。 SDS是一种有效变性剂，能破坏蛋白质分子中的氢键和疏水作用，而巯基乙醇能破坏二硫键，因此在二者作用下，单体蛋白质或亚基处于展开状态，SDS与蛋白质分子结合成复合体。 复合体的形成造成了2种结果： 1、不同蛋白质被阴离子SDS覆盖而具有相同密度的负电荷； 2、不同蛋白质单体分子由于SDS结合而具有统一的直径，但长度随蛋白质相对分子质量成正比变化。 聚丙烯酰胺凝胶的分子筛效应，使得电泳迁移率与多肽链分子量有如下关系： Log Mr = K1 – K2 （样品迁移距离 / 前沿迁移距离） 由于蛋白质分子上除了肽链两端有自由的α-NH2和α-COOH外，在侧链上还有很多解离基团（ε-NH2、γ-COOH、β-COOH、咪唑基、胍基（精氨酸）），在一定的pH条件下都能解离成带电基团，而使蛋白质带电。 二、两性电离及等电点 等电点：当溶液在某一定pH环境中，使蛋白质所带正、负电荷相等，净电荷为零，在电场中不向阳极也不向阴极移动。 H 2 O + P C O O - N H 2 H + O H _ P N H 3 + C O O - P N H 3 + C O O H H + O H - pH ＞ pI pH ＜ pI pH =pI 酸性氨基酸pI＜7，碱性氨基酸pI ＞7。蛋白质pI与所含氨基酸种类和数量有关，若蛋白质中碱性aa较多，其pI偏碱，如从雄性鱼类精子中提取的鱼精蛋白含Arg多，其pI 约为12 ； 若含酸性aa较多，则pI偏酸。 蛋白质在等电点时其溶解度、导电性、粘度、渗透压最小。 蛋白质等电点性质为电泳分离的依据. 三、胶体性质 蛋白质水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团（亲水基团向外翻，疏水基团向内钻），在蛋白质颗粒外面形成一层水膜（水化层）；同时，蛋白质颗粒在非等电点状态时带的相同电荷，使蛋白质颗粒间相互排斥，不致相互凝聚沉淀。 四、蛋白质的沉淀作用 如果使蛋白质成为胶体的稳定条件发生变化，就很容易使蛋白质变得不稳定而发生沉淀现象。 这种稳定条件变化方法有： （1）在蛋白质溶液中加入适当的试剂，破坏它的水膜或中和它的电荷。如无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等，中和电荷作用）、有机溶剂（乙醇、丙酮等，破坏水膜作用）； （2）调节溶液的pH值，使达到蛋白质的等电点而失去电荷； （3）加热法（失去活性）； （4）重金属盐（汞、银、铜盐等）、磷钨酸、三氯醋酸和生物碱等沉淀剂可使蛋白质沉淀（失去活性）。 五、蛋白质变性（denaturation） 在某些物理化学因素作用下，蛋白质分子内部的非共价键断裂，天然构象破坏，从而引起理化性质改变，生物活性丧失。 蛋白质变性后一级结构没有发生变化。只是空间构象发生变化。 蛋白质变性后其溶解度降低，粘度增加，生物活性丧失，易被蛋白酶水解。 变性蛋白质不一定都沉降，沉降出的蛋白质也不一定变性。 造成蛋白质变性的因素：强酸、强碱、尿素、重金属盐、乙醇、加热、紫外线、X线等。 复性：有的蛋白质变性后，将变性剂除掉，能恢复活性。 六、蛋白质的紫外吸收 Trp、Tyr在280nm处有特征吸收峰，可作蛋白质定量测定 七、蛋白质的呈色反应 （1）茚三酮反应（ninhydrin reaction）。 （2）双缩脲反应（biuret reaction）。肽键与双缩脲试剂反应呈紫色。氨基酸无此反应，可用于检测蛋白质水解程度。 第五节 蛋白质的分离与纯化 一、蛋白质的抽提原理与方法 原 理 大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数