糖类色谱分析.doc
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■目 录
1.前言 …1
2.糖的种类和物理性质 …1
2-1 单糖 …1
2-2 二糖?低聚糖 …2
3.在糖分析中使用的色谱柱 …3
3-1 正相色谱柱 …3
3-2 聚合体系强阴离子交换色谱柱 …4
3-3 反相色谱柱 …5
4.在糖分析中使用的检测器 …6
4-1 差示折射率计(RI检测器) …6
4-2 脉冲式电化学(PAD)检测器 …7
4-3 萤光检测器 …8
【参考文献】 …8
5.糖分析实例 …9
5-1 利用RI检测器进行糖分析的案例 …9
5-2 利用PAD进行糖分析的案例1 …15
5-3 利用PAD进行糖分析的案例2 …19
5-4 利用PAD进行糖分析的案例3 …23
5-5 利用FL检测器进行糖分析的案例1 …25
5-6 利用FL检测器进行糖分析的案例2 …28
5-7 利用LC-MS进行分析的案例 …31
1.前言
糖是三大营养素之一,是人体的构成成分及能源。糖是由C、H、O三种元素构成,由于可用一般式Cm(H2O)n表示,所以也被称为碳水化合物(carbohydrate)。广义地说,如“氨糖”、“酸性糖”那样,有时将含氨基以及酸性基的物质也分为糖类。或者是根据分子大小不同,有时也可将糖分为单糖、二糖等在20碳单位以内的低聚糖和淀粉、糊精、纤维素等多糖。
在本手册中,将对单糖、二糖的分析系统以及分析手法作以介绍。在使用HPLC进行分析时,由于一般的中性糖在紫外不产生吸收,所以必须对中性糖的检测方法进行深入探讨。在这里,将对糖分析中使用的色谱柱、检测器的特点、实际的测定系统以及分析案例作以介绍。
2.糖的种类和物理性质
2-1 单糖
单糖类可能形成环状以及直锁状的构造。如果是直锁状的构造,其末端是醛的单糖类(醛糖※),在水溶液中二种环状构造通过直锁型构造而保持平衡状态。如果是环状构造,羰基的碳(C1)也形成不齐碳,该位置的氢氧基不同方向的二种异性体被称为各自正位异构体。而且将C1称为正位异构体碳,将与C1相结合的OH称为正位异构体氢氧基。
※:形成直锁状而且具有酮基的糖被称为酮糖。
图1 水溶液中D-葡萄糖的构造
单糖类一般极易溶于水,难溶于甲醇、乙醇、丙酮等。另外,不溶于苯、酯、氯仿等。
2-2 二糖?低聚糖
二糖就是两个单糖,低聚糖是比较多的单糖通过糖苷结合而形成的糖类。如蔗糖、乳糖那样,二糖类具有人的营养所需要的重要成分。一般的低聚糖,有作为游离型或者是配糖体(糖和另外的化学种类相结合的物质)而在生理学上具有意义的大小而合成的、或者是作为多糖类的加水分解物而生成的。
从不同结合方式看,由于单糖间的结合方式不同,有还原性二糖类(麦芽糖型)和非还原性二糖类(海藻糖型)两种。在还原二糖类中,由于单方的正位异构体氢氧基和另外的乙醇性氢氧基结合,具有游离的正位异构体氢氧基,所以具有还原性,存在α型和β型两种异性体。在还原型二糖类中,有麦芽糖、乳糖、纤维素二糖、龙胆二糖等。如果是非还原性二糖类,由于构成单糖的正位异构体氢氧基相结合,不显示还原性。在非还原性二糖类中,有蔗糖、海藻糖等。
低聚糖易溶于水或者水和甲醇或者水和乙腈的混合溶液,不溶于苯、酯、氯仿等。
3.在糖分析中使用的色谱柱
作为糖分析中使用的色谱柱,大致有正相色谱柱、糖分析用色谱柱(强阴离子交换色谱柱)、可使用100%水的反相色谱柱等。
3-1 正相色谱柱
在糖类分析中最常使用的色谱柱是NH2色谱柱。但是存在一个问题,就是在传统的NH2色谱柱中,氨丙基直接与硅胶结合,氨基的强碱性会使基质硅胶溶出,在含水率高的流动相中,色谱柱寿命比较短。
在CAPCELL PAK NH2 UG80中,硅胶表面被硅酮聚合体保护,而且,在NH2基导入前,设置具有架桥构造的聚胺层。因此,与传统的NH2色谱柱比较,具有极强的化学稳定性。在SG80类(分离特性相同)中,充填剂表面的聚合体更加严密,其耐久性更加优越。 CAPCELL PAK NH2 UG80的物性值如表1所示。
表1 CAPCELL PAK NH2 UG80的物性值
基材 高纯度硅胶 官能团 含聚胺的架桥构造的NH2(氨基) 细孔径 ( nm ) 8 比表面积(m2/g) 450 C% 14 密度(μmol/m2) 1.4 可使用的pH范围 2 – 8
流动相使用乙腈/水的混合液。通过变化乙腈/水的比率,调整保留时间,水的比率越高,溶出越快。在使用NH2色谱柱的场合,如用水作样品溶剂,与流动相比较,溶出力比较强,会出现保持时间短的峰比较宽的情况。样品溶剂至少应该选择50%以上的乙腈,最好尽量作成与流动相相近的组成。糖类一般易溶于水,不溶于乙腈,所以在溶解样品时,应该采取首先将糖类于溶解水,再加乙腈或者是用流动相稀释等方法。
3-2 聚合体系强阴离子交换色谱柱
糖类的乙醇性氢氧基,
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