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肿瘤细胞培养流程规范
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CONTENTS
01
实验前准备
02
培养基配制
03
原代细胞获取
04
传代培养操作
05
质量监控体系
06
冻存与复苏流程
01
实验前准备
设备灭菌标准
灭菌方法
采用高温高压蒸汽灭菌法，确保设备无菌。
01
灭菌周期
每次实验前进行设备灭菌，并定期检查灭菌效果。
02
灭菌范围
包括所有实验使用的设备、器械和容器等。
03
试剂配制规范
选择优质、无污染的试剂，并确保符合实验要求。
试剂选择
按照试剂说明书进行配制，确保浓度和pH值准确。
配制过程
配制好的试剂需放置于合适的温度、湿度和光照条件下保存。
储存条件
生物安全防护
实验废弃物处理
实验废弃物需进行专门的处理，确保不对环境和人员造成污染。
03
实验人员需经过专业培训，掌握生物安全知识和实验技能。
02
实验人员
实验室设施
实验室需具备生物安全柜、防护手套、口罩等基本防护设施。
01
02
培养基配制
基础培养基选择
选择含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素等基础营养成分的培养基，如RPMI1640、DMEM等。
常规细胞培养
根据细胞类型及培养需求，选择特定基础培养基，如神经细胞培养常用的Neurobasal培养基。
特殊细胞培养
添加剂配比标准
血清
根据细胞生长需求，添加适量血清以提供生长因子、激素等生物活性物质。常规细胞培养中，血清浓度通常在10%左右。
生长因子与激素
抗生素与抗真菌剂
针对特定细胞类型，需添加适量生长因子与激素，如胰岛素、表皮生长因子等，以促进细胞增殖与分化。
为预防微生物污染，需添加抗生素与抗真菌剂，如青霉素、链霉素等。但需注意，某些细胞对抗生素敏感，需在使用前进行试验。
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PH值调节方法
01
液体培养基PH调节
使用酸碱溶液（如HCl、NaOH）调节培养基pH值至适宜范围，一般细胞生长的最适pH值为7.2-7.4。
02
气体环境调节
通过调节细胞培养箱内的CO2浓度，使培养基的pH值达到稳定。一般细胞培养箱内的CO2浓度维持在5%左右，以保持培养基的pH值稳定。
03
原代细胞获取
组织样本处理
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选择新鲜、无污染、无坏死组织的样本，避免使用化疗或放疗后的组织。
样本选择
将组织样本切割成小块，便于后续处理和细胞分离。
样本切割
使用无菌生理盐水或PBS清洗样本，去除血渍、脂肪和其他杂质。
样本清洗
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02
在适宜的温度和条件下保存样本，以保持细胞活性。
样本保存
04
酶解分离步骤
酶的选择
酶浓度和时间
酶解温度
终止酶解
根据组织类型选择适当的酶，如胰蛋白酶、胶原酶等。
确定酶的浓度和作用时间，以获得最佳的细胞分离效果。
在适宜的温度下进行酶解，避免细胞损伤。
使用适当的酶抑制剂或培养液终止酶解反应，保护细胞免受损伤。
保持适宜的温度、湿度和气体环境，如37℃、5%CO2等。
培养条件设置
根据细胞类型和生长特性，确定适当的接种密度。
细胞接种密度
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03
04
选择适合细胞生长的培养基，如DMEM、RPMI等。
培养基选择
定期观察细胞生长情况，及时更换培养基和进行传代培养。
培养过程中观察
原代培养条件
04
传代培养操作
消化终止时机
细胞形态变化
在显微镜下观察细胞形态，当细胞开始变圆、边缘清晰、细胞间隙增大时，为消化终止的最佳时机。
01
消化时间控制
消化时间不宜过长，一般控制在几分钟以内，以避免对细胞造成损伤。
02
消化液选择
选择合适的消化液，如胰酶、EDTA等，以确保消化效果。
03
细胞计数方法
在显微镜下直接观察细胞数量，适用于细胞密度较高的情况。
显微镜计数
利用细胞计数仪进行细胞计数，具有快速、准确、重复性好的优点。
细胞计数仪
使用血细胞计数板进行细胞计数，是一种常用的细胞计数方法。
计数板计数
传代比例控制
细胞状态观察
观察细胞生长状态，如细胞形态、透明度、贴壁性等，以判断细胞生长是否正常。
03
在培养过程中定期监测细胞密度，以便及时调整传代比例。
02
细胞密度监测
传代比例设定
根据细胞生长速度和实验需求，合理设定传代比例，以保证细胞在培养过程中保持适宜的密度。
01
05
质量监控体系
污染检测方法
常规细菌检测
真菌污染检测
支原体污染检测
病毒污染检测
通过培养检测细胞是否被细菌污染。
通过显微镜观察细胞是否有真菌污染。
使用PCR技术或培养法检测细胞是否受到支原体污染。
使用特定的病毒标志物检测细胞是否被病毒感染。
使用细胞活力试剂检测细胞存活率。
细胞活力检测
绘制细胞增殖曲线，评估细胞生长速度。
细胞增殖曲线
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02
03
04
通过显微镜观察细胞形态是否正常。
形态学观察
使用流式细胞术分析细胞周期，了解细胞增殖状态。
细胞周期分析
生长状态评估
染色体