正常和肿瘤组织细胞培养(课件).doc

正常和肿瘤组织细胞培养 内 容 正常组织细胞培养 上皮细胞的体外培养 血管内皮细胞的体外培养 肾小管上皮细胞的培养 巨噬细胞的培养 淋巴细胞的培养肿瘤细胞培养 上皮细胞的体外培养 上皮细胞的基本特征： 1.上皮组织的形态结构2.上皮细胞的极性3 . 上皮细胞间的连接 群体依赖性贴壁依赖性细胞-贴壁生长 接触抑制生长基质 体外培养的上皮组织细胞的生长生物学 1. 形态学结构均质性、透明性很强，结构不明显 2. 体外培养上皮组织的生长与增殖特征 (1) 体外培养的特殊条件： 防范微生物污染 生长基质的支持 特殊的培养基 M199 RPMI1640 DMEM Fam F12无血清培养基 去成纤维细胞 体外培养上皮细胞的形态学变化 体外培养上皮组织细胞的观察与检测 一般形态学观察 2. 组织化学与免疫组织化学观察与检测 酶类：碱性磷酸酶琥珀酸脱氢酶 特异性抗原标记物：角蛋白、上皮细胞膜抗原VIII因子、晶体蛋白、唾液酸糖蛋白 血管内皮细胞的体外培养 人脐静脉内皮细胞的培养 1.主要材料：组织来源：婴儿脐带 培养用液： M199+20%FCSD-Hanks、0.1%胶原酶溶液 培养方法：分离细胞培养法 1 ).?将15-20cm长的新生儿脐带放入无菌的PBS溶液中储存。（注：4℃下最多贮存24小时，室温下不超过6小时，否则废弃） 2 ).?用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌的PBS溶液冲洗3-5次，将污血冲洗干净为止。 3 ).?用手术钳夹紧脐带下端，加入15ml 的胶原酶（1mg/ml）室温下消化15-20分钟，并不时上下摇动脐带。 4 ).?消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个50 ml无菌离心管中，用无菌的PBS溶液冲洗脐带2-3次。 5 ).将收集液离心（2000转/分）3分钟，去上清，加入RPMI1640培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置CO2培养箱中培养，两至三天可见细胞长成单层。 肾小管上皮细胞的培养 原代培养：切取1cm3外层肾皮质、剪碎成1mm3→ 80目研磨冲洗、于100目上收集肾小管节段→0.2%胰蛋白酶消化、调整细胞数→接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶进行培养→每隔3~4天，更换培养液 传代培养： .培养结果： 3d 长出细胞 5~7d 进入对数生长期 7~9d 融合成单细胞层 .鉴定蛋白体染色） 巨噬细胞的培养获取巨噬细胞的方法 （一）肺泡巨噬细胞支气管肺泡灌洗法支气管镜肺泡灌洗法 腹腔巨噬细胞实验动物: 6周龄小鼠培养液：10%FCS RPMI1640 巨噬细胞的纯化 1、原理：巨噬细胞黏附能力强、贴壁快特点 2方法：用帖壁法纯化巨噬细胞用不连续密度梯度离心纯化巨噬细胞 淋巴细胞的培养 各类淋巴细胞的主要特征 T淋巴细胞：表面标志：1.表面受体：TCRSRBC R、Fc R、MR、Measles viruse R 2. 表面抗原：MHC、CD B淋巴细胞 血淋巴细胞的分离 （一）单个核细胞的分离 密度梯度离心法（二）纯淋巴细胞的制备（三）T、B淋巴细胞的分离 血淋巴细胞的体外1. 用IL-2建立T淋巴细胞克隆2. 用EB病毒转化B淋巴细胞3. 用B细胞生长因子建立B淋巴细胞株 肿瘤细胞体外培养 肿瘤细胞在体外的生长生物学特性 ㈠ 形态和性状 培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则，可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。 ㈡ 生长增殖 肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖，是因血清中含有很细胞增殖生长的因子，而癌细胞在低血清中（2％～5％）仍能生长。已证明肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。正常细胞发生转化后，出现能在低血清培养基中生长的现象，已成为检测细胞恶变的一个指标。 癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养时，形成集落（克隆）的能力比正常细胞强。另外癌细胞增殖数量增多扩展时，接触抑制消除，细胞能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物。㈢ 肿瘤细胞永生性 永生性也称不死性。在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡 浸润性正常和肿瘤组织细胞培养 1