分子荧光和磷光光谱.ppt

仪器Instruments第30页，共51页，星期日，2025年，2月5日仪器结构流程测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。第31页，共51页，星期日，2025年，2月5日光源激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；适用波长范围宽荧光计中，常使用卤钨灯作光源荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯利用汞蒸气放电发光的光源；常用其发射365nm、405nm、436nm三条谱线以365nm的谱线最强应用最广泛的一种光源，可发射250~800nm很强的连续光源第32页，共51页，星期日，2025年，2月5日同步扫描技术根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系，同步扫描可分为固定波长差(??)和固定能量差及可变波长三种；同步扫描技术可简化光谱，谱带变窄，减少光谱重叠，提高分辨率；如图。合适的??可减少光谱重叠；酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相似，发射光谱严重重叠，但??15nm的同步光谱只显示酪氨酸特征光谱；??60nm时，只显示色氨酸的特征光谱，实现分别测定。第33页，共51页，星期日，2025年，2月5日可获得三维光谱图的仪器可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图第34页，共51页，星期日，2025年，2月5日荧光分光光度计与紫外分光光度计的区别紫外-可见分光光度计荧光分光光度计光路光源仪器校正吸收池入射光与吸收光同方向入射光与荧光垂直方向两种光源(紫外+可见)一种光源(紫外)空白溶液(F=0)荧光对照品溶液(F=100%或50%)空白溶液(T=100%)紫外无吸收两面透光低荧光材料四面透光第35页，共51页，星期日，2025年，2月5日荧光分析方法与应用1.特点（1）灵敏度高比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；为什么？检测下限：0.1～0.1?g/cm-3相对灵敏度：0.05mol/L奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。（2）选择性强既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；（3）试样量少缺点：应用范围小。第36页，共51页，星期日，2025年，2月5日关于分子荧光和磷光光谱第1页，共51页，星期日，2025年，2月5日发光现象起因是吸收了外在提供的能量引起的外在的能量热电光化学能第2页，共51页，星期日，2025年，2月5日荧光入射光荧光1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍为长些，才判明这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光。他还由发荧光的矿物“萤石”推演而提出“荧光”这一术语.第3页，共51页，星期日，2025年，2月5日萤石纯净的萤石为无色，但因含有较多Y、Ce等元素，造成萤石结构空位，产生色心而致色，常见的颜色有浅绿色至深绿色，蓝、绿蓝、黄、酒黄、紫、紫罗兰色、灰、褐、玫瑰红、深红等。第4页，共51页，星期日，2025年，2月5日2001年美国遭受911袭击时，美国世贸大厦内一共有2万5千多人，人们惊讶地发现了一个世界都为之惊叹的纪录：两座大楼里，1万8千多人在上百层的大楼完全断电的情况下，在一个半小时之内成功逃生。第5页，共51页，星期日，2025年，2月5日绿色荧光蛋白GFP绿色荧光蛋白第6页，共51页，星期日，2025年，2月5日GFP第7页，共51页，星期日，2025年，2月5日原理GenerationofMolecularFluorescenceandPhosphorescence第8页，共51页，星期日，2025年，2月5日荧光和磷光的产生过程分子能级和跃迁电子能级、振动能级和转动能级基态（S0）→激发态(S1、S2、激发态振动能级）：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；第9页，共51页，星期日，2025年，2月5日荧光和磷光的产生过程电子激发态的多重度单重态S三重态T大多数有机分子的基态处于单重态三重态能级比相应单重态能级低S0→T1禁阻跃迁；通过其他途径进入(见能级图)；进入的几率小；第10页，共51页，星期日，2025年，2月5日激发态→基态的能量传递途径电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光