3.2基因工程的基本操作程序 课件（共30张PPT) 2025年人教版（2025）高中生物学选择性必修3.pptx
H的燕四
骗
花楷量通道法
用限制酶切断DNA
用连接酶连接目的基因
连接酶;
二、构建基因表达载体
1.酶切
·同种限制酶
·防止倒连、自连→两端选择两种限制酶
·防止切断目的基因等→载体和目的基因选同尾酶
·注意：限制酶特性;
能被限制性内切酶特异性识别的切割部位都具有回文序
列：
限制酶所识别序列的特点
是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的,称为回文序列在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链
反向读的顺序完全一致。;
2.连接
·DNA连接酶;④
构建基因表达载体⑤
大肠杆菌88
无菌牙签·
菌落一
乙
含青霉献和四环素含四环素;
f1(-)ori
np2)
pBLUE-T
2984bp
ori
PGEM-34
转化
培养基中
加X-gal
IPTG
菌落蓝色;
转化(transformation)是指目的基因进入
受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能
在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。根据农杆菌的这种特点，如果将目;
1.将目的基因导入植物细胞
(1)农杆菌转化法
一特点：
易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。
Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。;
两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)指
被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。
两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)
是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。;
(2)花粉管通道法用微量注射器将含有目的基因的DNA溶液直接注入子房中
在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因??助花粉管通道进入胚囊。;
2.将目的基因导入动物细胞
(1)方法：显微注射法
(2)操作：
提纯含目的基因表达载体显微注射
受精卵
移植到输卵管或子宫
受精卵发
新性状动物;
(2)常用法：Ca2+处理(感受态细胞法)
常用菌：大肠杆菌
(3)过程：
Ca2+处理感受态
大肠杆菌细胞;
胰岛素原
胰岛素
cDNA
mRNA
21
提取逆转录
胰岛素S
重组质粒
质粒;
检测转基因生物染色体的DNA上是否插
入了目的基因
目检测目的基因是否转录出了mRNA头检测目的基因是否翻译成蛋白质;
能与目标DNA或RNA的一条链发生碱
基互补配对。
基因探针
待测DNA
F;
(2)方法：RNA分子杂交(3)方法：抗原-抗体杂交
各种RNA各种蛋白质
q
SDS-聚丙烯-
酰胺凝胶电泳
硝酸纤
维素膜
抗原一抗体杂交
⑤放射
自显影;
例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后
不出现中毒症状，说明未摄入目的
基因或摄入目的基因未表达。如虫
吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫
基因并得到表达。;
基因编辑
·1.CRISPR/Cas9
·一设计合适的向导序列
·自将向导序列和Cas9基因构建基因表达载体
·为转化
·④表达并组装Cas9/gRNA复合体
·⑤定点切割(敲除绝大部分外显子/敲除个别外显子，移码突变)·⑥鉴定(PCR:扩增出的条带小或者无条带/分子杂交/测序);
目Cre-lox介导的基因组特定位点重组
·1、两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相同，Cre重组酶敲除loxP间的序列；
·2、两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相反，Cre重组酶诱导loxP间的序列翻转；
·3、两个loxP位点位于不同的DNA链或染色体上，Cre重组酶诱导两条DNA链发生交换或染色体易位。
InversionDeletionTranslocation;
筛选高效表达外源基因的基因座;
探究和实践
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