植物基因克隆方法.ppt

******************1、差异杂交筛选（differentialhybridizationscreening）2、mRNA差异显示(differentialdisplay)3、DNA表达文库（expressionlibrary）4、DNA结合蛋白基因的分离5、信号传递蛋白基因的分离6、图位克隆技术（Map-basedcloning）第31页，共47页，星期日，2025年，2月5日酵母双杂交体系酵母双杂交体系(yeast-twohybridsystem,Y2H)是上一世纪九十年代初期在转录因子结构基础上发展起来的一种敏感的检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法，亦即是体内鉴定基因的方法。它不仅可有效地用来分离能与一种已知的靶蛋白(targetprotein)相互作用的另一种蛋白质及其编码基因，而且可以用来确定蛋白质相互作用的特异性结构域及其氨基酸序列。第32页，共47页，星期日，2025年，2月5日方法构建两种E.coli-Yeast穿梭质粒载体:已知基因与BD序列融合表达融合的蛋白质叫做诱饵蛋白质(Baitprotein)第一种质粒载体又叫做诱饵质粒载体或DNA-BD质粒载体(具Trp基因)。第33页，共47页，星期日，2025年，2月5日第二种质粒载体又叫做文库质粒载体或AD质粒载体，它具有亮氨酸基因(leu)，是用来构建cDNA表达文库的专用载体。cDNA编码蛋白质与GAL4-AD多肽融合这种与AD融合的蛋白质叫做基因文库编码蛋白质，其中可与诱饵蛋白质发生相互作用的特称为捕获蛋白质(preyprotein)第34页，共47页，星期日，2025年，2月5日AD:GAL4ActivationDomain;DNA-BP:DNABindingProtein;USA：Upstreamactivatingsequence.GAL1UAS启动子LacZ(orHIS3)报告基因GAL1UAS启动子LacZ(orHIS3)报告基因GAL1UAS启动子LacZ(orHIS3)报告基因转录DNABDADDNABD(a)(b)(c)XYADXY第35页，共47页，星期日，2025年，2月5日1、差异杂交筛选（differentialhybridizationscreening）2、mRNA差异显示(differentialdisplay)3、DNA表达文库（expressionlibrary）4、DNA结合蛋白基因的分离5、信号传递蛋白基因的分离6、图位克隆技术（Map-basedcloning）第36页，共47页，星期日，2025年，2月5日图位克隆技术图位克隆(Map-basedcloning)又称定位克隆(positionalcloning),1986年首先由剑桥大学的Alancoulson提出，用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA顺序，也无需预先知道其表达产物的有关信息，但应有以下两方面的基本情况:一是有一个根据目的基因的有无建立起来的遗传分离群体。二是开展以下几项工作:1)首先找到与目标基因紧密连锁的分子标记；2)用遗传作图和物理作图将目标基因定位在染色体的特定位置；3)构建含有大插入片段的基因组文库(BAC库或YAC)；4)以与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库；5)用获得阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群；6)通过染色体步行、登陆或跳跃获得含有目标基因的大片段克隆；7)通过亚克隆获得含有目的基因的小片段克隆；8)通过遗传转化和功能互补验证最终确定目标基因的碱基序列。第37页，共47页，星期日，2025年，2月5日DNAmarkersforgeneticmaps●第38页，共47页，星期日，2025年，2月5日eg.ThebreastcancergeneBRCA1MappingofBRCA1Toisolatethegene,thefirststepistodeterminewhichchromosomecontainsitandthepositionofthegeneonthischromosome.第39页，共47页，星期日，2025年，2月5日第40页，共47页，星期日，2025年，2月5日第41页，共47页，星期日，2025年，2月5日图位克隆存在的问题图