DB23_T3168—2022_盐碱土壤嗜盐细菌与古菌资源分离与快速分类技术规程_黑龙江省.docx
ICS65.020.20
CCSB05
DB23
黑龙江省地方标准
DB23/T3168—2022
盐碱土壤嗜盐细菌与古菌资源分离与快速分
类技术规程
黑龙江省市场监督管理局
DB23/T3168—2022
前
言
本文件依据GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由黑龙江省农业农村厅提出。
本文件起草单位：黑龙江省农业科学院土壤肥料与环境资源研究所。
本文件主要起草人：王爽、孙磊、金品娇、李伟群、陈雪丽、万书明、刘凯、李一丹、孙秀君。
I
DB23/T3168—2022
盐碱土壤嗜盐细菌与古菌资源分离与快速分类技术规程
1
范围
本文件规定了盐碱土壤嗜盐细菌与古菌资源分离与快速分类技术的术语和定义、原理、一般要求、
分离方法和分类方法。
本文件适用于盐碱土壤中嗜盐细菌和嗜盐古菌的分离与快速分类。
2
规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，
仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本
文件。
GB/T19495.2
GB/T19495.3
NY/T1114-2006
转基因产品检测
实验室技术要求
转基因产品检测
核酸提取纯化方法
微生物肥料实验用培养基技术条件
NT/T1377土壤pH的测定
第16部分：土壤水溶性盐总量的测定
3
术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
在盐环境中生长旺盛的一类喜盐的微生物，包括原核生物（细菌和古菌）和真核生物。根据它们对
氯化钠的需求，可分为轻度（最适盐浓度0.2mol/L～0.5mol/L）、中度（最适盐浓度0.5mol/L～2.5
分类学上属于细菌域（Bacteriadomain），在0.2mol/L～2.5mol/L盐浓度范围内有最佳生长的
分类学上属于古菌域（Archaeadomain），在含2.5mol/L～5.2mol/L盐浓度范围生长最好的一类
1
DB23/T3168—2022
分类（classification）
选择特定的引物，采用聚合酶链式反应（PCR）法快速扩增嗜盐细菌和嗜盐古菌分离株的16SrRNA
基因，在进一步测序的基础上进行16SrRNA基因序列的系统发育学分析来判定所属细菌或古菌的类别。
4
原理
16SrRNA序列的系统发育学进化距离与表型特征及化学分类数据有非常好的相关性，但传统的微生
物分类学方法比较繁琐费时，而PCR快速扩增嗜盐细菌和嗜盐古菌的16SrRNA基因相对简单快捷。本方
法采用细菌和古菌的特异性引物对分离菌株的16SrRNA基因进行PCR扩增，对PCR产物进行电泳检测、纯
化和测序，并将测得的分离菌株的16SrRNA基因序列和来自GenBank数据库中的序列进行比较和系统发
育学分析，来鉴定其为细菌还是古菌。
5
一般要求
试验操作人员应具备良好的微生物学知识积累和分子生物学专业技能，操作熟练。实验室有毒、有
害、废弃物质的处理及个人安全防护应符合GB/T19495.2的要求。
6
分离方法
6.1
工具
电子天平（万分之一），2mm孔径的筛子，往复式电动振荡机，锥形瓶，无菌大试管，无菌水，
微量可调移液器（100μL～1000μL），培养皿，玻璃刮铲，接种环，全自动高压灭菌锅，超净工作
6.2.1
嗜盐细菌分离培养基的选择
营养琼脂培养基（NA），复合培养基（CM），TSA培养基，培养基成分及配制要点见附录A；R2A
培养基和海盐琼脂培养基（2216E）可于厂家购买。
稀释10倍的复合培养基（CM），改良高氏一号（Cause1）培养基，稀释10倍的改良S-G培养基，
培养基成分及配制按附录A。
培养基的配制按照NY/T1114-2006中6的要求进行。培养基平板的制备应符合NY/T2321-2013
中5.1.4.1的要求，对于培养古菌的固体培养基要稍厚一些，且制备好的培养基应放置无菌密封袋中于
4oC保存。
新鲜土壤样品需进行过2mm孔径筛的预处理，按照NY/T2321-2013中5.1.4.2的要求用系列稀释
方法获得不同浓度的土壤悬浮液（菌悬液）。对于不能立即用于微生物分离的新鲜土样应暂存于4oC
2
DB23/T3168—2022
6.4
6.5
土壤pH和水溶性盐总量的测定
土壤pH和水溶性盐总量的测定分别按照NT/T1377和NT/T1121.16的规定进行。
菌悬液的加样及培养
6.3中的土壤悬浮液按照NY/T2321-2013中5.1.4.3的要求涂布在制备好的培养基平板上，在