动物A型流感病毒与北美种和欧洲种猪繁殖与呼吸综合征病毒三重实时荧光RT-PCR检测方法.pdf

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动物A型流感病毒与北美种和欧洲种猪繁殖与呼吸综合征病毒三重

荧光RT-PCR检测方法

1范围

本文件规定了动物A型流感病毒与北美种和欧洲种猪繁殖与呼吸综合征病毒三重荧光RT-PCR检测

方法操作规程。

本文件适用于动物A型流感病毒与北美种和欧洲种猪繁殖与呼吸综合征病毒的鉴别诊断。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

AIV-A：动物A型流感病毒（AnimalInfluenzaAVirus）

PRRSV-NA：北美种猪繁殖与呼吸综合征病毒（NorthAmericanPorcineRespiratoryandReproductive

SyndromeVirus）

PRRSV-EU：欧洲种猪繁殖与呼吸综合征病毒（EuropeanPorcineRespiratoryandReproductive

SyndromeVirus）

FAM：6-羧基荧光素（6-Carboxyfluorescein）

Cy5：荧光发光基团

Hex：六氯-6-甲基荧光素（6-Hexachlorofluorescein）

BHQ：荧光淬灭基团

5仪器和设备

1

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多通道荧光PCR仪、生物安全柜、冰箱（2℃~6℃和-20℃）、台式冷冻离心机、组织匀浆机、漩

涡器、移液器及吸头（至少包括10μL、200μL和1000μL三个量程）。

6试剂和耗材

6.1试剂

6.1.1病毒总核酸提取试剂TIANampVirusDNA/RNAKit或者其他等效核酸提取试剂。

6.1.2Path-IDTMMultiplexone-stepRT-PCRkit或者其他等效多重荧光RT-PCR试剂。

6.1.3无水乙醇（分析纯）和75%乙醇（用新开启的分析纯无水乙醇和DEPC处理水配制）及实验用

水按照GB/T6682规定使用，-20℃预冷。

6.2阳性对照

动物A型流感病毒体外转录的非感染性RNA片段、北美种和欧洲种猪繁殖与呼吸综合征病毒体外转

录的非感染性RNA片段，片段序列见附录A。

6.3阴性对照

动物A型流感病毒阴性样品、北美种和欧洲种猪繁殖与呼吸综合征病毒阴性样品。

6.4引物和探针序列

引物和探针序列见附录B。

7病料采集和处理

病料采集和处理，按照NY/T541有关规定进行。

8病毒核酸提取

病毒核酸提取见附录C。

9荧光RT-PCR反应

9.1多重荧光RT-PCR反应体系

多重荧光RT-PCR反应体系组成见附录B。

9.2荧光RT-PCR反应程序

将反应体系混合液充分混合后，最后加入模板，瞬时离心，按照下列反应程序（见表1），进行一

步法荧光RT-PCR反应。

表1荧光RT-PCR反应程序

温度反应时间循环数

48℃10min1

2

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