高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒微滴式数字RT-PCR检测方法.pdf

ICS 11.220 B 41 团 体 标 准 MA T/CVMA 6—2018 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒微滴式 数字RT-PCR 检测方法 Method of Droplet Digital RT-PCR for Detection of Highly Pathogenic Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome Virus 2018 - 10 - 24 发布 2018 - 10 - 24 实施 中 国 兽 医 协 会 发 布 T/CVMA 6—2018 前 言 本标准按 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由中国兽医协会提出并归口。 本标准起草单位：中国动物疫病预防控制中心、河南省动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：原霖、王传彬、杨林、班付国、宋晓晖、辛盛鹏、闫若潜、董浩、周智、张硕、 赵柏林、赵雪丽、刘洋、刘颖昳、曲萍、蒋菲、陈亚娜。 I T/CVMA 6—2018 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒微滴式数字RT-PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highly Pathogenic Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome Virus，HP-PRRSV）微滴式数字RT-PCR检测方法的试剂与耗材、仪器与设备、操 作步骤、结果分析。 本标准适用于高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 原理 微滴式数字PCR （Droplet Digital PCR，ddPCR）的技术原理是利用微滴化技术将一份反应体系分 成数万个纳升级的微滴进行定量PCR检测，本质上是将传统定量PCR的一次检测变成数万次检测，提高了 检测的灵敏度和精准度。微滴发生器可以将每一份扩增体系分成数万个均匀的纳升级微滴，每个微滴不 含或者含有一个至数个待检核酸靶分子。每个微滴都将作为一个独立的PCR扩增体系，在PCR扩增仪上进 行终点PCR扩增。利用微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号 的微滴判读为0。然后根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，计算出待检靶分子的浓度或拷贝数。 4 试剂与耗材 4.1 提取试剂 宜选取商品化的病毒RNA提取试剂盒。 4.2 微滴式数字RT-PCR 扩增试剂 宜按照不同的微滴式数字PCR平台的说明书选取推荐的微滴式数字PCR扩增试剂。 4.3 引物和探针 HP-PRRSV 上游引物 （HP-PRRSV F ）：5 ＇-CCCHAGCTGATGACACCTTTG -3 ＇ HP-PRRSV 下游引物 （HP-PRRSV R ）：5 ＇-AATCCAGAGGCTCATVCTGGT -3 ＇ 1