蛋白质共价结构.ppt

多肽链的专一性裂解化学裂解法:1）溴化氰断裂CNBr只断裂由甲硫氨酸残基的羧基参加形成的肽键。由于大多数蛋白质只含有很少的甲硫氨酸，因此CNBr裂解产生的肽段不多。这些肽段可以用胰蛋白酶处理使成更小的肽段。断裂反应在70％甲酸中进行，使卷曲的多肽链松散，暴露甲硫氨酸侧链，有利于和CNBr发生作用。第94页，共145页，星期日，2025年，2月5日溴化氰基锍甲基硫氰酸肽酰高丝氨酸内酯溴化亚氨内酯第95页，共145页，星期日，2025年，2月5日第96页，共145页，星期日，2025年，2月5日2）羟胺断裂：羟胺（NH2OH）在pH9下能专一性地断裂Asn-Gly之间肽键。但专一性不很强，Asn-Leu及Asn-Ala键也能部分裂解。反应式如下：第97页，共145页，星期日，2025年，2月5日酶解方法：用于肽链断裂的蛋白水解酶是一种肽链内切酶或叫内肽酶（endopeptidase）。常用的有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（也称糜蛋白酶）、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶等。第98页，共145页，星期日，2025年，2月5日1）胰蛋白酶（trypsin）胰蛋白酶的专一性强，只断裂由Lys或Arg残基的羧基端肽键，产生以Arg和Lys为C-末端残基的肽段。通过化学修饰将待测多肽链中Lys残基或Arg残基的侧链基团保护起来，可以减少胰蛋白酶的作用位点。用氮丙啶处理多肽链将Cys残基修饰成S-氨乙基半胱氨酸（AECys）残基，可增加多肽链中胰蛋白酶的断裂点。第99页，共145页，星期日，2025年，2月5日2）胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）胰凝乳蛋白酶又称糜蛋白酶，其专一性不如胰蛋白酶强，可以断裂Phe、Trp和Tyr或其他疏水性氨基酸残基的羧基端肽键。如果断裂的肽键附近存在碱性基团，可以增强该酶的裂解能力，而酸性基团可以减弱其裂解能力。第100页，共145页，星期日，2025年，2月5日3）嗜热菌蛋白酶（thermolysin）嗜热菌蛋白酶的专一性较差，能水解疏水性氨基酸残基如Leu、Ile、Phe、Val、Tyr、Met等的氨基端肽键。第101页，共145页，星期日，2025年，2月5日4）胃蛋白酶（pepsin）胃蛋白酶的专一性也较差，能水解疏水性氨基酸残基（Phe、Leu、Trp、Tyr等）的氨基端肽键。由于二硫键在酸性条件下稳定，而胃蛋白酶的最适pH值为2，因此常用胃蛋白酶来水解肽段来确定二硫键的位置。第102页，共145页，星期日，2025年，2月5日5）其他蛋白酶葡萄球菌蛋白酶又称为Glu蛋白酶。在磷酸缓冲液（pH7.8）中，断裂Glu残基和Asp残基的羧基端肽键；在碳酸氢铵缓冲液（pH7.8）只断裂Glu残基羧基端肽键。梭菌蛋白酶又称为Arg蛋白酶，专一性裂解Arg残基的羧基端肽键，在6mol/L尿素中作用20h内仍具活力，对不溶性蛋白质的裂解将是相当有效的。木瓜蛋白酶（papain）的专一性差，对Arg和Lys残基的羧基端肽键敏。第103页，共145页，星期日，2025年，2月5日第104页，共145页，星期日，2025年，2月5日Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr–Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-AlaB链15710151920212530Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Ala-Ser-Val-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn15102015A链711621SSSS牛胰岛素的化学结构S————————S第62页，共145页，星期日，2025年，2月5日二、蛋白质一级结构的内容1.多肽链的数目。2.每条肽链中氨基酸的排列顺序。3.二硫键的数目和位置（链内、链间）。第63页，共145页，星期日，2025年，2月5日牛胰岛素由51个氨基酸残基组成：A链：21个氨基酸残基B链：30个氨基酸残基A链和B链间2对-S-S-键A链内1对二硫键。第64页，共145页，星期日，2025年，2月5日三、蛋白质一级结构测定的步骤1.蛋白质分子中多肽链的数目2.多肽链及二硫键的拆分与保护(亚基分离)3.多肽链氨基酸组成分析4.多肽链末端分析5.多肽链裂解成肽段（多种方法的部分水解）6.测定肽段氨基酸序列7.重叠肽段方法排序8.二硫键位置的确定第65页，共1