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乳制品中乳铁蛋白的测定

摘要采用高效液相色谱法建立了乳制品中乳铁蛋白测定的分析方法。试样

中的乳铁蛋白经磷酸盐缓冲液提取，提取液经肝素亲和柱净化后，采用反相高效

液相色谱柱分离，以二极管阵列检测器于280nm处检测，采用外标法定量。结

果表明：乳铁蛋白在10.0～1000.0ug/mL范围内线性良好，添加回收率为75%～

110%，相对标准偏差（RSD）小于20%。该方法具有灵敏度高、准确度高、重

现性好的特点，适合检测机构或乳品企业日常样品中乳铁蛋白的检测。

关键词乳铁蛋白；高效液相色谱法；肝素亲和柱

乳铁蛋白是近年来国内外开发研究速度最快的一种营养添加剂，由于其具有

广谱抗菌、抗病毒感染、调节体内铁平衡、调解骨髓细胞的生成、抑制人体肿瘤

细胞、同多种抗生素及抗真菌制剂协同有效治疗疾病等功效，使其产品在国内外

乳制品加工中的应用范围日益广泛[1-3]。我国《食品营养强化剂使用标准

（GB14880-2012）》中规定婴幼儿配方食品中乳铁蛋白的最大允许使用量为1.0

g/kg，而目前国内外未建立与乳制品中乳铁蛋白测定相关的国家标准。为保证乳

铁蛋白的安全生产和使用，该文建立了乳制品中乳铁蛋白的检测方法，最大限度

地保证市场中乳铁蛋白添加型产品的安全和质量水平，以保证乳制品安全，促进

行业健康发展[4]。

1材料与方法

1.1供试材料、试剂与仪器

1.1.1供试材料。供试材料为婴幼儿配方奶粉、婴幼儿配方米粉、成人配方

奶粉。

1.1.2试剂与仪器。Agilent1200高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器。

肝素亲和柱（美国通用医药有限公司）。乙腈（色谱纯，美国Sigma公司产品），

无水乙醇、氯化钠、磷酸、磷酸氢二钠、三氟乙酸（分析级，国药集团化学试剂

有限公司产品）。超纯水NanopureLifeScience（赛默飞世尔科技有限公司）。离

心机JouanCeterifugeMR23i（赛默飞世尔科技有限公司）。

1.2试验方法

1.2.1提取试剂的选择。在相同试验条件下分别以水和磷酸缓冲液作为提取

试剂，测定样品加标回收率，比较水和磷酸缓冲液对样品中乳铁蛋白的提取效果。

1.2.2提取温度的选择。乳铁蛋白分子量为80kDa，是具有大约700个氨基

酸残基序列的单体糖蛋白，并连接1～2个配糖体。对于这一类大分子量的蛋白

质，提取溶剂温度过高会造成乳铁蛋白结构的变化，致使检测结果偏离实际值。

研究分别选取25、50、60、70、80、90℃进行比较。准确吸取1mL200μg/mL

的标准溶液于EP管中，分别于25、50、60、70、80、90℃下恒温水浴1，上

机测定[5-6]。

1.2.3肝素亲和柱的选择。肝素（Heparin）是一种含硫酸酯的酸性多糖，有

文献报道乳铁蛋白可与这类多负电荷分子糖胺多糖结合。故在该文中采用

HiTrapTMHeparinHP（1mL）肝素亲和柱作为目标化合物纯化和浓缩的前处理

步骤。通过经过和未经过肝素亲和柱纯化的样品比较图，分析其对乳铁蛋白检测

应用的可行性[7]。

1.3液相色谱条件

色谱柱：C4，5μm，300A（孔径），250mm×4.6mm（内径）；检测波长：

280nm；柱温：30℃；进样体积：50μL；流速：1.0mL/min；流动相：0.1%三

氟乙酸溶液和乙腈，梯度洗脱参数如表1所示。

1.4样品前处理

1.4.1提取。准确称取1g试样（试样中含乳铁蛋白0.1～10.0mg）于50mL

烧杯中，加入5mL温热的磷酸氢二钠溶液（温度不超过50℃），搅拌使样品完

全溶解，将样品全部转入50mL具塞塑料离心管中，再向原烧杯中加入5mL磷

酸氢二钠溶液，合并2次液体。漩涡振荡器振荡2min，于室温下3000r/min离

心10min。将上层脂肪层和下层沉淀层之间的液体小心转移到另一个50mL离

心管中，再向原离心管中加入5mL磷酸氢二钠溶液重复操作1次，合并2次液

体作为样品