《DNA片段的PCR扩增》复习课件.ppt

(1)在相应的横线上写出引物Ⅱ，并在复性这一步骤中将引物Ⅱ置于合适的位置。(2)在相应的横线上写出循环一次后生成的DNA分子。(3)若将作为原料的四种脱氧核苷酸用32P标记，请分析循环一次后生成的DNA分子的特点是________；循环n次后生成的DNA分子中不含放射性的单链占总单链的比例为________。[解析](1)DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链，引物就提供了3′端。子链延伸方向为5′→3′，引物Ⅰ与b链部分碱基互补，引物Ⅱ则与a链部分碱基互补，且连接到a链的3′端，故引物Ⅱ的结构为5′－G－A－OH，复性结果为：HO－A－G－5′5′－G－G……T－C－3′。(2)经过一次循环后，产生的两个DNA分子分别含有引物Ⅰ和引物Ⅱ。(3)由于作为原料的四种脱氧核苷酸被32P标记，所以新合成的子链均含有放射性，一次循环后的两个DNA各有一条链含32P，若复制n次，产生子链共2n×2，其中只有亲本的两条母链不含32P，则其所占比例为2/(2n·2)＝1/2n。[答案](1)5′－G－A－OHa链5′－G－G……T－C－3′HO－A－G－5′(2)5′－G－G……T－C－3′3′－C－C……A－G－5′3′－C－C……A－G－5′5′－G－G……T－C－3′(3)每个DNA分子各有一条链含32P标记1/2n微量移液器1．实验操作程序准备：按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上移液：用按照配方在微量离心管中依次加入各组分混合：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁：将微量离心管放在离心机上，离心约10s。目的是使反应液集中在?反应：将离心管放入中，设置程序进行反应。离心管底部PCR仪离心2．DNA含量的测定(1)原理：利用DNA在的紫外线波段的吸收峰曲线来测定相应含量。(2)计算公式：DNA含量(μg/mL)＝50×(260nm的读数)×稀释倍数。260nm1．实验操作注意事项(1)为避免外源DNA等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行高压灭菌。(2)所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃储存。(3)在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。所有成分都加入后，通过手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀。2．结果分析与评价DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测量，以判断DNA片段的扩增是否成功。具体方法如下：(1)稀释：取2μLPCR反应液，加入98μL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释。(2)对照调零：以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。(4)计算：检测DNA片段的扩增情况，可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，计算公式为：DNA含量(μg/mL)＝50×(260nm的读数)×稀释倍数。(3)测定：取DNA稀释液100μL至比色杯，需测定260nm处的光吸收值。如果扩增不成功，则要分析失败原因。可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。公式中的50代表在波长260nm紫外波段照射下，吸收峰为1时，DNA含量为50μg/mL。特别提醒理论上DNA扩增呈指数增长。若只有一个DNA分子作模板，则复制n次后有2n个DNA分子；若一开始有m个DNA分子作模板，则复制n次后有m×2n个DNA分子；实际操作过程中由于无关变量的影响，一般来说实际值要略小于理论值。归纳拓展DNA扩增数目的理论计算退出**************知识点一PCR扩增的原理和过程知识点二PCR扩增的实验操作自主预习，自我领悟难重聚焦，质疑解惑知识点一PCR扩增的原理和过程自主预习，自我领悟难重聚焦，质疑解惑知识点二PCR扩增的实验操作自主预习，自我领悟难重聚焦，质疑解惑实验13

DNA片段的PCR扩增1．细胞内DNA复制的条件原料4种模板2条DNA母链酶