多聚酶链式反应扩增DNA片段　课件　2.ppt

多聚酶链式反应扩增DNA片段 多聚酶链式反应（PCR） 1、概念： 又称为基因的体外扩增法，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA片段的技术，它能以极少少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝，能有效地解决因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。 2、PCR原理 （1）DNA复制的条件： 模板——亲代链 原料——核苷酸 能量——ATP 酶——解旋酶等 适宜的温度：PCR仪自动调控 适宜的PH：用一定的缓冲溶液调节 （2）参与的组分： （3）DNA复制方向：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3`端延伸DNA链，故DNA复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3`端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5`端向3`端延伸。 （4）DNA的热变性原理：在80~100℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性；当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链，这个过程称为复性。 （5）PCR反应的条件： 一定的缓冲溶液； DNA模板； 分别与两条模板链相结合的两种引物； 四种脱氧核苷酸； 耐热的DNA聚合酶； 控制温度； 3、PCR过程 3、PCR过程 DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。 配方及微量移液器 实验步骤 实验操作循环程序 DNA含量的测定 练习巩固 * * 使DNA聚合酶能够从引物的3`端开始连接脱氧核苷酸 引物 催化合成DNA子链 DNA聚合酶 合成子链的原料 4种脱氧核苷酸 提供DNA复制的模板 DNA母链 打开DNA双链 解旋酶 在DNA复制中的作用 参与的组分 5’ 3’ (a) 第一轮 引物2 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 3’ 5’ 引物2互补链 5’ 3’ 引物1互补链 (b) 第二轮 变性 新引物 新延伸 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ (c) 第三轮 以第二轮产物为模板，重复第二轮过程。 5’ 3’ 引物1 引物2互补链 引物2 引物1互补链 引物1 引物2 第一次 第二次 第三次 第四次 引物2互补链 目的片段 （不同长度的链未示出） PCR反应的温度循环周期 PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。 温度（℃） 时间（min） 94 72 60 94℃变性（1min） 60 ℃退火（1min） 72 ℃延伸（1.5min） 循环1 循环2 循环3 准备好PCR反应体系的配方 用微量移液器按配方在往微量离心管中加入各组分 盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁混合反应液 离心10分钟 将离心管放入PCR仪上，设置好循环程序进行反应 稀释→对照调零→测定→计算 DNA含量（ug）=50×（260nm的读数） ×稀释倍数 1、关于PCR技术的应用，错误的一项是 A 古生物学、刑侦破案、DNA序列测定 B 诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学 C DNA序列测定、基因克隆、刑侦破案 D 诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测定 *