实验五葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质.ppt

葡聚糖凝胶柱层析法分离蛋白质;教学目标: 了解： 1. 层析技术的基本原理。 2. 有效分配系数Kav的计算。 理解： 葡聚糖凝胶的选择和准备。 掌握： 1. 凝胶层析的原理和操作方法。 2. 有效分配系数Kav的意义。 ;教学重点： 凝胶层析的原理和实验步骤。 教学难点： 掌握装柱、加样、洗脱、收集样品的操作步骤。 教学对象： 临床医学五年制本科;使用教材： 《生物化学与分子生物学实验技术》，杨安钢主编，高等教育出版社，2008年第1版 参考资料： 《生物化学》，贾弘褆主编，人卫出版社，2005年第1版 推荐网站： 1. 第三军医大学生物化学与分子生物学教研室： 33:8002/ 2. 美国国立生物技术信息中心： ;层析法又称色谱法或色层分析法，1903年茨维特（M.S.Tsweet）利用活性碳酸钙与石油醚的共同作用把叶绿素分离呈现出不同颜色的色谱带。茨维特把上述分离方法叫做色谱(chromatography); 利用混合物中各组分的物理、化学性质 的差别，使各组分以不同程度分布在两相(固定相、流动相)中达到分离。;固定相(Stationary phase ) ：是色谱的基质，可以是固体物质（如吸附剂、凝胶、离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些物质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用。 流动相(Mobile phase ) ：在色谱分离过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等。;层析的分类;层析的分类;层析的分类; 1. 吸附层析;凝胶层析 (分子筛过滤、排阻层析);固定相（凝胶）;;凝胶层析的原理;凝胶层析的数理关系 ;Ve－Vo;(1) Ve = Vo Kd = 0;本实验中用Sephadex G 50（分离分子量范围1500~30000），以蒸馏水为洗脱剂（流动相）。 分离蛋白A（黄色，分子量在G 50的分离范围内）与蛋白B（蓝色，分子量大于G 50的分离范围内）的混合物。;实验步骤 ;二、装柱;3. 将凝胶悬液沿玻璃棒小心地徐徐灌入柱中，待底部凝胶沉积1-2cm时，再打开出口，继续加入凝胶悬液至凝胶沉积约15cm高度即可（注意：凝胶悬液尽量一次加完，以免出现分层的凝胶带）。 4. 新??装好后，加3-5倍体积蒸馏水流过柱床，然后平衡10min。（注意：始终层析柱与水平面垂直） ;三、加样与洗脱;移液器正确使用;四、样品收集;实验注意事项; 利用吸附层析介质表面的活性分子或活性基团，对流动相中不同溶质产生吸附作用，利用其对不同溶质吸附能力的强弱而进行分离的一种方法，称之为吸附层析。 常用的吸附剂：硅胶、氧化铝、活性炭、聚酰胺、磷酸钙;分配层析(partition chromatography); 分配系数：在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中浓度的比值，常用K值表示。 ;离子交换层析(ion exchange chromatography);亲和层析(affinity chromatography);1. Incubate crude sample with the immobilized ligand ;聚丙烯酰胺凝胶;化学性质： 在水溶液、有机溶液、盐溶液中都较稳定。 在强碱和高温下易发生分解。 聚丙烯酰胺凝胶不带电荷，吸附效应小。 ;琼脂糖凝胶;琼脂糖凝胶特点;小 结;思考题;Thank You!