蛋白质印迹法westernblot应用介绍.ppt

威斯腾生物技术中心 2014.9.1 蛋白质印迹法 （western blot技术） Western Blot介绍 Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析 Western Blot 介绍 蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治·斯塔克（George Stark）。在尼尔·伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的《分析生物化学》（Analytical Biochemistry）中首次被称为Western Blot。 蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现己广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。 Western Blot流程 （1）贴壁细胞蛋白样品收集 A 收集培养瓶或六孔板中的培养液转移至离心管中。 B 加入PBS冲洗2-3遍，再将PBS转移至离心管中，离心收集细胞。 C 将细胞培养瓶或六孔板置于冰上，然后将离心好的离心管中的液体小心倾尽并放置于冰中，加入含PMSF的RIPA裂解液200μl于离心管中并移至对应的培养瓶中，摇晃培养瓶使裂解液与贴壁的细胞充分接触，冰上裂解30min。 D 裂解结束后用细胞刮将贴壁的细胞刮下并转移至1.5 ml EP管中，再用超声破碎仪破碎细胞后，4℃下12000rpm离心15min，吸取上层液体于新的离心管中，弃掉沉淀。 收集蛋白样品(Protein sample preparation) 分多次将细胞收至一个管中 （2）．蛋白含量测定（福林-酚法 ） 目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford法（考马斯亮蓝法）、Lowry法（福林-酚试剂法）、 BCA法等。 1、配制BSA标准溶液：0、25、50、100、150、200、300 μg/mL（用PBS配制）。 样品液：取原液2 μL至200 μL （用PBS配制）。 2、操作：先取一块新的96孔板，于630nm下测光密度值，取溶液/样品40μL和E液40μL，每个浓度点均作三复孔，振荡混匀。37°C反应10 min后，加入福林酚试剂（1:15稀释）160μL，振荡混匀，37°C反应30 min。630 nm下测光密度值。以标准蛋白浓度对光密度值作出标准曲线，计算待测样品蛋白浓度。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离胶浓度与蛋白分离范围 凝胶浓度（％） 最佳分离范围（KD) 6 50-150 8 30-90 10 20-80 12 12-60 15 10-40 1、配制下层胶（分离胶） 静置1h后制上层胶（浓缩胶） 2、配制上层胶（浓缩胶） 加完后插上梳子，静置1h (1) SDS凝胶配制 制胶 操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。 加完分离胶后胶，加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。 灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。 分离胶充分凝固就倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。 插梳子时要使梳子保持水平。 制胶过程注意事项： (2) 上样与电泳  将制备好的样品溶解后，把蛋白样品直接上样到SDS胶加样孔内即可。跑上层胶，70V 35Ma/块 45 min；跑下层胶，100V 35Ma/块胶 1 h左右。 转膜(Transfer) 半干转移法 将凝胶和固相基质象三明治一样夹在用缓冲液湿润滤纸间。 －|纸|胶|膜|纸|＋ 槽式湿转法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中。 － |海绵|纸|胶|膜|纸|海绵|＋ 转膜注意事项 滤纸、胶、膜之间不能有气泡。 滤纸、胶、膜的大小和摆放顺序。 胶和膜上要做好标记，识别正反面和上下 。 PVDF膜需要100%甲醇预处理，后续操作中膜必须保持湿润。 转膜条件： 推荐：100V ，1—2小时；根据蛋白大小以及胶厚度的不同而不同。 转膜后检测（此步可以省略） 丽春红染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的Western印迹过程。 封闭(Blocking) 将转印膜浸泡到封闭液中，将膜上没有结合蛋白质的区域结合上蛋白质，目的是使抗体与特异的蛋白质结合。 封闭液 5 % TBST脱脂奶粉溶液（30ml） 牛血清白蛋白溶液( BSA ) 摇床上缓慢摇动封闭，室温2 h或4℃过夜。 Tween