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SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） 实验目的 了解电泳实验原理 掌握电泳实验操作规程 用电泳方法测定蛋白分子量 影响电泳速度的因素： 样品本身：带电量，分子大小，形状 电场强度：电压 缓冲液：成分， pH ，离子强度 支持介质：电渗作用，吸附作用 温度 分类 连续电泳 不连续电泳 非变性电泳 变性电泳 非变性电泳 变性电泳 测定亚基分子量 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠） 1967年，Shapiro等人首先发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中加入一定量的SDS，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小 SDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。因此蛋白质在含有强还原剂的SDS溶液中与SDS分子结合时，可形成SDS-蛋白质复合物。这种复合物由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用 因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)按照缓冲液的pH值和凝胶孔径的差异及有无浓缩效应分为连续系统和不连续系统两大类 连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应 不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳 当蛋白质的分子量在15,000－200,000之间时，样品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。 符合如下方程式：Lg MW =－b ? m R + K 其中，MW 为蛋白质的分子量，m R 为相对迁移率，b为斜率，K为截距。当条件一定时，b与K均为常数 因此通过已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较，就可以得出未知蛋白的分子量 凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。用5～15%的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范围如下表： 操作过程 1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干净的小烧杯2.把玻璃板在灌胶支架上固定好 3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入（或直接用小烧杯倒入）,大约5厘米左右,之后加少许蒸馏水,静置至胶凝  * 凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡 * 水封的目的：保持分离胶上沿平直，排气泡 * 胶凝好的标志：胶与水层之间形成清晰的界面 4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入梳子,静置到胶凝  * 梳子需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平 5.拔出样梳后, 在槽中加入缓冲液 6.上样： （1）marker 5μl （2）样品10 μl + 2×上样buffer 10μl 共20μl 100℃沸水浴，3-5min ？（蛋白变性） 7. 微量注射器（加样器）上样, 上样量 15μl  *微量注射器不可过低,以防刺破胶体；也不可过高, 样品下沉时易发生扩散，溢出加样孔 8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA（120V），当进入分离胶后改为20mA（180V），溴酚蓝距凝胶边缘约数cm时，停止电泳  9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入考马斯亮蓝染色染色液，染色1小时左右 10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰 *剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分 11.实验结果分析 双向电泳 第一向：等电聚焦电泳第二向：SDS双向电泳后的凝胶经染色后蛋白呈现二维分布图： 水平方向反映出蛋白在pI上的差异， 垂直方向反映出它们在分子量上的差别。 第一向电泳：等电聚焦电泳 聚焦后凝胶放置在SDS凝胶上，进行第二向电泳 第二向电泳：SDS分子量大 分子量小 pH9 pH3 pH9 pH3 大肠杆菌全蛋白提取液双向电泳凝胶染色后照片 单体：丙烯酰胺（Acr）； 交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）； 催化剂：过硫酸胺或核黄素； 加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）； 产物：三维网状结构凝胶。 聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel, PAG）的聚合反应： 分离胶(10% 10ml) 浓缩胶(5% 10ml) ddH2O 4.05ml 6.8ml