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葡萄酒中维生素B2的测定液相色谱-串联质谱法

1.范围

本文件规定了葡萄酒中维生素B2含量的液相色谱-串联质谱测定方法。本文件适用于枸萄酒中维生素B2含量的测定和确证。

2.规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。3.术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。4.原理

样品经混匀、离心、过滤，液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量。5.试剂和材料

除另有说明，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的一级水。

5.1试剂

5.1.1甲酸铵(NH4HCO2)：色谱纯。

5.1.2甲醇(CH3OH)：色谱纯。

5.2溶液配制

5.2.15mmol/L甲酸铵溶液：称取0.1576g甲酸铵(5.1.1)，用超纯水定容至500mL混合均匀。

5.3标准品

维生素B2标准物质：纯度均不低于99.0%，CAS号：83-88-5，分子式：C17H20N4O6

5.4标准溶液制备

5.4.1标准储备液（100.0μg/mL）：准确称取适量的标准物质（5.3），加入2mL盐酸水（1+1），超声溶解后转移至100mL棕色容量瓶，用超纯水定容至100mL，制备浓度为100.0μg/mL的标准储备液，于4℃冰箱中避光保存。

5.4.2标准中间液（1.0μg/mL）：吸取维生素B2标准储备液1mL,用超纯水定容至100mL,得到浓度为1.0μg/mL的标准中间液，4℃冰箱中避光保存。

5.4.3标准工作液：移取适当体积的标准中间溶液，用流动相将维生素B2配制成质量浓度为10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0ng/mL的标准工作液，现用现配。

6仪器和设备

6.1液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾电离源。

6.2分析天平：感量为0.00001g和0.01g。

6.3高速离心机：15000r/min。

6.4涡旋混合器。

6.5具塞塑料离心管：2.0mL。

6.6超声波振荡器。

6.7微孔滤膜（水相）：0.22μm。

7分析步骤

7.1试样制备

起泡葡萄酒需预先脱气。将100mL试样倒入带排气塞的瓶中，置于超声波振荡器(6.6)中脱气，直至无气体逸出。

7.2试样的提取

将葡萄酒试样摇匀，取一定量试样于塑料离心管中，于15000r/min离心5min，上清液过0.22μm滤膜，供液相色谱-串联质谱分析。

7.3仪器参考条件

7.3.1液相色谱参考条件

a)色谱柱：C8色谱柱（100mm×2.1mm，3.5μm),或相当者；

b)柱温：30℃;

c)进样量：5μL；

d)流速：0.3mL/min；

e)流动相A：5mmol/L甲酸铵溶液（5.2.1），流动相B：甲醇（5.1.2）

7.3.2质谱参考条件

a)离子源：电喷雾离子源（ESI）；

b)扫描方式:正离子扫描；

c)检测方式：多反应离子监测（MRM）；

d)脱溶剂气、碰撞气均为高纯氮气或其它合适气体；

e)破碎电压、碰撞能等参数应优化至最优灵敏度；

f)监测离子参数情况见表1。

表1离子参数

化合物

母离子m/z

子离子m/z

破碎电压V

碰撞能eV

去簇电压V

维生素B2

387.0

243.1a

135

32

55

172.0

125

54

a为定量碎片离子。

7.4定性与定量测定

7.4.1定性测定

在同样测试条件下，试样中维生素B2的保留时间与标准溶液中维生素B2的保留时间之比，偏差在±2.5%以内，且检测到的相对离子丰度，应当与浓度相当的校正标准溶液相对丰度一致。其允许偏差应符合表2的要求。

表2定性测定时相对离子丰度最大允许偏差

相对丰度(基峰)

50%

20%～50%(含)

10%～20%(含)

10%

允许的相对偏差

±10%

±15%

±20%

±50%

7.4.2定量测定

取试样溶液和相应的标准溶液，作校准曲线，以色谱峰面积定量，按外标法计算，标准溶液及试样溶液中维生素B2响应值均应在仪器检测的线性范围内，在上述液相色谱质谱条件下，维生素B2标准溶液的特征离子质量色谱图见附录A。

7.5空白试验

除不加试样外，采用相同的测定步骤进行操作。

8结果计算和表述

试样中维生素B2各组分含量按标准曲线法或按公式（1）计算