单增李斯特菌环介导等温扩增快速检测方法的建立.pdf
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中国畜牧兽医文摘 2017年 33卷 第2期 基 础 科 学
单增李斯特菌环介导等温扩增快速检测方法的建立
1,2 2 1
杨爱华 李秀梅 韩文瑜
(1.吉林大学动物医学学院,吉林长春 130062;
2.天津市动物疫病预防控制中心,天津 300402)
[摘 要] 研究针对细胞增生性李斯特菌(以下简称单增李斯特菌)hlyA基因设计了4条特异性的环介导等温核酸扩增(loop-
mediated isothermal amplification,LAMP)引物,通过优化反应条件,建立了单增李斯特菌的LAMP快速检测方法。特异性和敏感
性试验结果显示,该方法能够特异地检测单增李斯特菌,其最低检测限为3 CFU/mL。扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳、显色反应进行
判定。LAMP可以快速、直观、准确地检测单增李斯特菌,是一种适合基层现场应用的检测方法。
[关键词] 单增李斯特菌 环介导等温扩增 快速检测 hlyA基因
单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一种重要的人 表1 引物序列表
畜共患病原菌和食源性病原菌,人畜在食用了被该菌污染的食物 引物序列 引物序列5’-3’ 引物长度/bp
后,除了出现恶心、呕吐、腹痛等一般细菌性食物中毒症状外, ATGTGAAATGAGCTAGCTTGCT-
还会导致脑膜炎、骨髓炎、败血症、心肌炎、流产等,病死率高 FIP CGAAATTGTTCAACATAAAAACTGG 47
达30%。该菌在自然界分布广泛,4℃的环境中仍可生长、繁殖, TTGCCTGGTAACGCGAGAAA-
BIP 38
增加了冷藏食品威胁人类健康的风险,WHO已将该菌列为重点检 TACCGTTCTCCACCATTC
测的食源性致病菌之一,因此,建立快速、准确的检测方法对保 F3 GAAGTAAATTATGATCCTGAAGGTA 25
证人类和动物生命安全具有重要意义。
B3 GGTAAGTTCCGGTCATCAA 19
目前,用于单增李斯特菌的检测技术主要有细菌分离鉴定、
免疫学方法和PCR等,但上述方法花费时间较长,而且判定结果 菜碱浓度和反应温度进行优化,具体梯度如下:内、外引物浓
需要借助精密仪器设备,难以在基层生产中普及应用,因此建立 度比分别为:4、6、8、10,外引物终浓度为0.2 μmol·L-1 ,其
-1
一种简单、快速、准确的病原诊断方法显得十分必要。Notomi等 对应的内引物终浓度分别为:0.8、1.2、1.6、2.0 μmol·L ;
于2000年发明了环介导等温核酸扩增技术,该技术依赖4条特异性 Mg2+终浓度分别为2、3、4、6、8、10 mmol·L-1 ;甜菜碱终浓
引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶,在等温条件下快速、 度分别为:0.4、0.6、0.8、1.0mmol·L-1 ;反应温度分别为61、
高效、高特异、高灵敏地扩增靶序列。本试验针对单
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