细胞培养基本技术实践、细胞培养传代计数与冻存详解.ppt

细胞培养 Cell culture 模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞生存、生长并维持结构和功能的一门技术。 实验室常用的细胞培养 常用的名称 组织来源 Hep-2 HeLa A549 Vero HEK CHO … 人喉癌 人子宫颈癌 人肺癌 非洲绿猴肾 人胚肾 中国地鼠卵巢细胞 … 代表性的细胞命名法 细胞名称 命名意义 HeLa 为供体患者的姓名（来源于宫颈癌） CHO 中国地鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary） 宫-743 宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立 NIH3T3 美国国立卫生研究所（National Institute of Health）建立；每3天传代，每次接种3×105细胞／毫升。 美国已有美国标准细胞库或细胞银行（ATCC）和人遗传突变细胞库（HGMR）、细胞衰老细胞库（CAR）等，其中 ATCC不仅是美国也世界最大的细胞库。ATCC也是世界卫生组织WHO的国际培养细胞文献中心。ATCC现液氮冻存有3200个已经过鉴定的细胞系，其中包括来自正常人和各种疾病患者的皮肤成纤维细胞系和来自不同物种的近75个杂交瘤细胞株。ATCC接纳来自世界各国已经鉴定的细胞予以贮存，同时也向世界各国的研究者或实验室免费提供研究用细胞（做盈利性研究时收费）。 每代贴附生长细胞的生长过程 游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期） 细胞培养方式 群体培养（mass culture），将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层 克隆培养（clonal culture），将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆（clone）。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。 群体培养（左）和克隆培养（右） 完全培养基的组成 基础培养基 80％一95％ 血清 5％一20％ 碳酸氢钠 2.0 g/L 青、链霉素 各100单位／毫升 培养基的配制 RPMI-1640培养粉 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 各100单位／毫升 加三蒸水 至 1000ml，过滤除菌。 调节pH值至7.2 加血清（终浓度 10％） 细胞培养基本方法（无菌原则） 无菌工作台用75%酒精擦拭干净，紫外线照射30分钟以上。 清洗双手及手腕，戴乳胶手套，然后用75%酒精擦拭。 操作时注意无菌台内空间层次。整个操作过程尽量在无菌台靠里面一点。手及物品不要在暴露的瓶口上方来往，严格注意无菌操作。 细胞传代方法 根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。 悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 半悬浮生长细胞传代 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。 贴壁生长细胞传代方法 吸光培养瓶中的培养液 PBS洗去残留培养液 加入1-2 ml 0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准） 静置2-10 min（显微镜下动态监测）。 加入培养液，终止胰酶消化作用。 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。 吸取1/3细胞悬液，接种于新的培养瓶内。 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。 将后者放入培养箱中培养。 细胞冻存和复苏 细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。 冻存和复苏的原则：慢冻快融 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损