5免疫荧光技术(修改后) 2.ppt

光路程序： 白炽光源 —— 发射紫外光or兰紫光 —— 激发滤板 ——紫外光 ——被检物（荧光染色标本）——紫外光＋荧光 —— 抑制滤板——荧光（显微镜下可见）  1.直接法 待测标本固定（Ag？） + Ab 快、直接、干扰因素少 用于检测抗原 每检测一种抗原需标记相应的荧光抗体,较麻烦 3.补体法： 第一步：荧光素标记抗补体； 第二步：已知Ag固定＋待测标本（Ab？）＋补体——洗涤，＋荧光标记的抗补体——洗涤，荧光显微镜镜检 （二）间接法测抗体 步骤： 包被已知Ag＋待测标本（测Ab？） ——反应一段时间后，洗涤——加酶标抗抗体（酶标羊抗人IgG）——洗涤——加底物——加终止液 ，观察结果。 该法主要用于测抗体 酶标记一种抗抗体可以用于多种抗 体的检测 包被抗体 加标本（抗原） 加抗体 加酶标抗抗体 间接法测抗原 （三）双位点一步法 步骤：包被抗体A＋待测标本 ＋酶标抗体B ——洗涤，＋底物——终止液，观察结果 （检测Ag，Ag至少含A、B两个抗原表位） 该法是一次性加入标本和酶标抗体，试 验程序简单，提高了检测的特异性 用于检测Ag , 且Ag是具有至少2种抗原表 位的多价抗原 反应系统中固相Ab与酶标Ab的量相对于待测Ag是过量的，因此复合物的形成量与待测Ag含量成正比（在方法可检测范围内） （四）竞 争 法 步骤： 待测管：已知Ab包被＋待测标本（Ag？）—— 洗涤，＋酶标Ag——洗涤，＋底物——显色 先加 先加 （五）应用亲和素和生物 素的ELISA 亲和素(avidin)：糖蛋白，一分子由四个亚基组成，每一亚基可以与一分子生物素结合 生物素(biotin)：维生素H，可与蛋白质、糖类、酶类等结合，与亲和素特异结合后极稳定 亲和素 生物素 生物素 生物素 生物素 亲和素— 生物素在ELISA中使用： 三.ELISA结果的判定 （一）肉眼判定 与阳性、阴性对照颜色比较： 结果判定 2.若待检孔显色深于或等于阳性对照孔则判 定为阳性； 3.若待检孔显色介于阴性对照孔和阳性对照 孔之间则判定为弱阳性。 1.若待检孔显色浅于阴性对照则判定为阴性； （二）酶标光度仪检测A492值 （吸光率）：比色法 1.与阳性、阴性对照测定值比较 2.P/N比值：大于2.0为阳性，小于2.0 为阴性 P: positive（待测吸光度值） N: negative 四.ELISA试验的影响因素 （一）固相载体 常用固相载体材料：聚苯乙烯。其特点为吸附Ag或Ab的能力强，一但吸附后，不能被洗脱。 固相载体：酶标板 可分软、硬板 一次性使用，不可回收 酶标板要求： 吸附性能好、空白值低、透明度高 板批间、孔间性能相近 （二）抗原、抗体 Ag：需纯化 Ab：需效价高、亲和力强、纯化 （三）试验条件 1.包被： 一般用pH 9.6 CB(carbonate buffer)，0.05M, 有利于蛋白质吸附 特点： 灵敏度高，制备一种荧光抗补体用于多 种检测 干扰因素多，补体不稳定，易失活， 该法少用 4.双标记法 用两种荧光素（FITC、罗丹明）分别标记针对同一Ag上不同抗原表位的抗体，对同一标本染色，当Ag有两种相应抗原表位存在时，可同时见到黄绿和橙红两种荧光。 （四）免疫荧光显微技术优缺点 优点： 1.特异性、敏感性高 2.快速 3.可定位 4.既可测Ag又可测Ab 缺点： 1.需要荧光显微镜 2.存在非特异荧光干扰（产生原因：自发、抗体不纯、交叉反应、技术问题） 3.定性测定、判断结果不客观 4.制备的片子难以长期保存（荧光猝灭） 三.时间分辨荧光免疫测定 （液相检测） 原理： 用铕(Eu)等具有较长荧光寿命的稀土金属作荧光标记物来标记Ab或Ag ，从而检测待测标本中相应Ag或Ab的新技术。 其特点是：利用时间分辨荧光仪延缓检测时间，排除非特异性干扰荧光。 灵敏度可达0.2 ~1 ng/ml。 思考题： 1.免疫标记技术的原理 2.免疫荧光技术中最常用的荧光素是什么？ 3.免疫荧光显微染色的各种方法及优缺点 免疫酶技术 Immunoenzyme technique 概述： 70年代初在免疫荧光技术基础上建立。 较IF、RIA(radioimmunoassay)更