免疫荧光技术分析.ppt

免疫荧光技术 一、一些基本概念和基本知识： 1 荧光免疫测定技术的概念：将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技术，称为免疫荧光素技术。 2.技术分类： ⑴荧光抗体技术(荧光显微镜技术) 抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判 定结果的检测方法。 ⑵ 免疫荧光测定技术： 抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定 荧光强度而推算被测物浓度的检测方法 荧光的产生： 物质吸收外界能量而进入激发状态，在回复基态时多余的能量以电磁辐射的形式释放，即发光，这种光称为荧光。 这种物质，称为荧光素 由光激发所引起的荧光，为光致荧光 ------荧光免疫技术 由化学反应所引起的荧光，为化学荧光 ------化学发光技术 荧光素的荧光特性： ⑴ 停止供能，荧光现象随即终止 ⑵ 对光的吸收和荧光的发射具高度选择性 入射光波长发射光波长 ⑶ 荧光效率： 发射荧光的光量子数 荧光效率= 吸收光的光量子数 ⑷ 荧光猝灭现象：荧光素的辐射能力减弱 5 常见荧光素： ⑴ FITC ⑵ RB200 ⑶ TRITC ⑷ 镧系：Eu、Tb ⑸ PE ⑹ 其它 常见荧光素的特性： ⑴ FITC：黄色结晶粉末，吸收光：490~495nm， 发射光：520~530nm，明亮的黄绿色荧光。 ⑵ RB200： 橘红色粉末, 吸收光570nm，发射光 595~600nm，橘红色荧光。 ⑶ TRITC： 紫红色粉末，吸收550nm，发射光 620nm，橙红色荧光。 ⑷ 镧系：Eu、Tb ⑸ PE：吸收光490~560nm，发射光595nm，红色 荧光。 ⑹ 其它：酶作用后产生荧光物质。 酶作用后产生荧光物质： 酶 底物 产物 激发光 发射光 Β-G MUG MU 360 450 AP MUP MU 360 450 HRP HPA 二聚体 317 414 合适荧光素的选择 ⑴ 具有与蛋白质形成共价键的化学基团。 荧光素-N=C +NH-蛋白质 荧光素-N-C-N-蛋白质 ‖ ︱ ︱‖ ︱ S H H S H ⑵ 荧光效率高，标记后下降不明显。 ⑶ 荧光色泽与背景色泽对比鲜明。 ⑷ 标记后能保持生物学活性和免疫活性 ⑸ 标记方法简单、快速。 ⑹ 安全无毒 二、 荧光抗体的制备 1 荧光素与抗体结合（标记） 2 荧光抗体的纯化 3 荧光抗体的鉴定 荧光素与抗体结合方法： ⑴ 透析法：①适用于蛋白质含量低、样品体 积小的抗体溶液的标记 ②标记较均匀，非特异荧光较低 ⑵ 搅拌法：①适用于蛋白质含量较高、样品 体积较大的抗体溶液的标记 ②标记时间短、效率较高，荧