薄层色谱法基础详解.ppt

薄 层 色 谱 法（Thin-layer Chromatography，TLC） 生物与化学工程系：刘西岭 2015年12月16日 目 录 一 基本原理 二 薄层层析的操作 三 操作演示 二.薄层色谱的操作 吸附剂的选择 薄层板的制作 展开剂的选择 点样 展开 显色 (一) 薄层层析用的吸附剂 常用的薄层层析吸附剂有硅胶、氧化铝、纤维素、聚酰胺等。 吸附剂的选择：首先决定于样品成分的性质，即它们的溶解性、酸碱性、极性以及是否与吸附剂起化学反应等； 其次要考虑吸附剂、载体是否容易得到及其价格等。 (三)薄层层析中展开剂的选择 主要根据极性的不同来选择流动相展开剂。 各种展开剂按其极性不同排序为： 烷烃烯烃醚类硝基化合物二甲胺酯类酮类醛类硫醇胺类酰胺醇类酚类羧酸 选择薄层条件的简图 Stahl设计的用以选择薄层条件的简图 （1）为被分离化合物的极性（2）为吸附剂的活度（3）为展开剂的极性。若将这三个因素各自固定在圆周的三分之一，转动圆盘正中的三角形，如果角A指向极性物质，则角B指向活度小的吸附剂，角C就指向选用极性展开剂；如转到A’，B’，C’处则又要作另外的选择组合。 例： 环己烷-丙酮-二乙胺-水（10:5:2:5）这个系统中，水是极性大的溶剂，环己烷是极性小的溶剂，后者的加入可以降低分离物质的Rf值，丙酮起着混匀整个系统及降低展开剂粘度的作用，少量二乙胺的加入控制了展开剂的pH值以使分离后的斑点不致拖尾，分离清晰。 (四) 点 样 1.样品溶液 最好用与展开剂极性相似的溶剂溶解试样，配成0.5%~1%的试液。 2.点样量 点样量的多少与薄层的性能、厚薄及显色剂的灵敏度有关。 3.点样方式 最好是直径3—5mm的圆点。 4. 点样容器 定容毛细管 微量注射器 点样器 (五) 展 开 1. 水蒸气的影响 2. 溶剂蒸气的影响 3. 展开槽 4. 展开方式 1.水蒸气的影响 在吸附薄层色谱的展开过程中，空气的相对湿度以及展开槽中的水蒸气必须严格控制，微量的水也能对色谱分离结果产生较大的影响。 适宜的相对湿度范围也决定于溶质和溶剂的极性。 2. 溶剂蒸气的影响 “边缘效应”：Stahl在用氯仿-甲醇（95：5）为展开剂展开麦角生物碱时发现，对同一种生物碱，在薄层板中部的Rf值比在边缘的Rf值小，称此现象为“边缘效应”（edge effect）。 展开槽中被展开剂蒸气饱和后再进行展开就可以消除。 3.展开槽 普通展开槽 双底展开槽 水平展开槽 4.展开方式 5 展开操作 1.展开槽的密闭 2.展开槽的饱和 3.展开距离 4.展开温度 展距对结果的影响，硅胶HPTLC 分离洋甘菊油， a）3 cm、 b）5 cm、 c）7 cm、d）9 cm。 (六)薄层层析的定性检测 展开完毕后，把薄层从层析缸中取出，用铅笔划出或小针刺出展开剂前缘的位置，随即进行显色，以确定各个斑点的位置、Rf值和显色情况，从而判断试样中含有哪些组分。 有色物质经展开后呈现明显的色斑，很易判断。 对于无色物质，可根据化合物的性质，用物理检出法、化学检出法、酶与生物检出法和放射性检出法进行显色。 1 物理检出法 1 .紫外光 紫外光常用两种波254nm与365nm。 如果化合物能吸收紫外光同时放出荧光，可用此荧光定位。 2. 碘 元素碘的最大特点是与物质的反应往往是可逆的，当化合物定位以后在空气中放置时，碘即升华挥去，可以回到组分的原来状态，有利于薄层的进一步处理。 3. 水 水可作为一种非破坏性显色剂，用于硅胶薄层，当许多憎水性化合物展开后，用水喷薄层板，对光观察，在半透明的薄层板上，显出白色不透明的斑点。 2.化学检出法 化学检出法是在薄层上使用一种或数种化学试剂与被检出物质反应，生成有颜色的化合物而定位。这种试剂叫显色剂。 显色剂 一般分为两类，即通用显色剂和专属性显色剂。 1 通用显色剂 (1) 浓硫酸或50%的硫酸溶液：极大多数有机物质，喷此种显色剂后立刻或在加热到110—120℃并经数分钟后出现棕色到黑色斑点。 (2) 酸碱指示剂溶液：例如0.3%溴甲酚绿甲醇溶液，在绿色背景上显现黄色斑，表示是