生11生化分析技术考试内容.ppt

一、色谱法的定义 色谱法又叫色层分析法，层析法。是指利用混合物中各组分的物理化学性质（如分子形状、大小、分子极性、吸附力、亲和力、分配系数等）的不同，使各组分得到分离的技术。 五、色谱法的特点 1.应用范围广 几乎可以用于所有化合物的分离和测定。 2.分离效率高 可分离性质极为相似的物质及复杂的混合 物，有机同系物、异构体、手性异构体。 HPLC 3万塔板数/米 毛细管色谱 7~12万塔板数/米 3.分析速度快 一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个 试样的分析。 4.灵敏度高，样品用量少 可以检测出10-11～10-13g的物质。 气体样品为mL级，液体样品为μL级，固 体样品为μg级。 不足之处： 难以定性。若没有已知纯物质的色谱 图，很难判断某一色谱峰代表何种物质。对 被分离组分（未知物）的定性较为困难。现 在发展了色谱与其它分析方法联用技术，如 GC-MS、GC-IR、GC-电化学等，解决了 难以定性的难题。 气相色谱由以下几个主要部分构成： （2）净化干燥管（净化器） （3）载气流速控制装置 减压阀、针形稳压阀、流量计、压力表， 控制载气流速恒定。 （1）进样器 高效液相色谱与经典液相色谱的比较 高速 高效 高灵敏度 高自动化 由于HPLC具有以上优点，又称作高速液相色谱或高压液相色谱。 高效液相色谱与气相色谱的比较 GC中，样品必须要有一定的蒸汽压，气化后才能分离。 对于挥发性差的物质（高沸点化合物），气化温度和柱温必须很高，这对设备和可分析的样品都带来困难和限制。 高效液相色谱与气相色谱的比较 HPLC不受样品挥发度和热稳定性的限制 液相一般在室温下操作，最高温度不会超过流动相溶剂的沸点。只要被分析物质在流动相中有一定溶解度，就可以分析。 液相色谱特别适合于沸点高、极性强、热稳定性差的化合物。 高效液相色谱与气相色谱的比较 HPLC中由于流动相也影响分离过程，为分离的控制和改善提供了有利条件。 GC中载气一般不影响分离，主要靠改变固定相来改变选择性。 液相中除了改变固定相，还可通过改变洗脱剂达到同一目的。因此液相中的固定相，只需有限的几种或几十种就可以解决相当范围的问题。 高效液相色谱与气相色谱的比较 和气相色谱相比，HPLC对样品的回收比较容易，而且定量。 因此，液相色谱不仅作为一种分析方法，而且可以作为一种分离手段，用以提纯和制备具有中等纯度的单一物质。 在气相色谱中所分离出的各样品组分虽也可以回收，但一般都不太方便，而且定量性差。 分子筛效应： 按分子大小不同，在凝胶受到的阻滞作用有差异，从而造成各组分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。 琼脂糖凝胶： 商品名称：Sepharose（瑞典，pharmacia） Bio-Gel-A（美国，Bio-Rad） 型号：2B，4B，6B; Bio-G 0.5M，1.5M，5M，15M，50M，150M。 型号含义：琼脂糖浓度为2%，4%，6%; 阿拉伯数字乘以106表示排阻限度。 特点：亲水性强，理化性质稳定，网孔大，非专一性吸附 小，只能以湿态保存，经不起有机溶剂处理。温度稳定范围 较窄，低于0℃会使颗粒结构遭受不可逆的破坏，而高于40℃ 凝胶会熔解。因此不能用高温灭菌，可采用化学方法灭菌。 适合于组分分子量差异较大的混合物的分离。 聚丙烯酰胺凝胶： 并非天然产物，是通过化学方法合成的。 商品名：Bio-Gel P 商品型号：P-2至-300 型号含义：排阻限度，×1000相当于允许进入凝胶内部蛋白 质的最大分子量。数字越大表示交联度越小，可分离的分子 量越大；而数字越小则交联度越大，可分离的分子量越小。 特点：理化性质稳定，抗微生物侵袭能力较大，适用于配基 和亲和物之间亲和力比较弱的系统，应避免在pH2-11以外的 溶液中长期使用。 特异性洗脱 优点： 特异性强，可以进一步消除非特异性吸附的影响，从而 得到较高的分辨率；洗脱条件温和，大分子物质不易变性。 缺点： 平衡比较慢，往往需要较长的时间和较大的洗脱条件； 价格昂贵。 特异性洗脱：是指利用洗脱液中的物质与待分离物质 或与配体的亲和特性，而将待分离物质从亲和吸附剂 上洗脱下来。 选择与配体有亲和力的物质进行洗脱； 选择与待分离物质有亲和力的物质进行洗脱。 （2）洗脱 采用降低目标产物与配体之间亲和力的方式进行洗脱。 非特异性洗脱：是指通过改变洗脱缓冲液pH、离子强度、 浓度、温度等条件，降低待分离物质与配体的亲和力而将待 分离物质洗脱下来。 注意：尽量不