第14章基因重组和基因工程协和版.ppt

基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering 相关概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体 基本原理 重组DNA技术与医学的关系 （二）工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 限制性内切酶酶解中常出现的问题： （1）DNA未被切割或切割不完全 内切酶失活或非最佳条件。 （2）酶切后未观察到DNA片段存在 无ＤＮＡ或未混匀 （3）电泳后，DNA片带弥散不清，不均一 内切酶星号活力或其它核酸酶污染。 （三）目的基因(target gene)： 所要克隆并进行研究的基因。 cDNA (complementary DNA) 指经反转录合成的、与RNA (通常指mRNA或病毒RNA)互补的单链DNA。以单链cDNA为模板、经聚合反应可合成双链cDNA。 基因组DNA (genomic DNA) 指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体)的所有DNA序列。 （一）目的基因的获取 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 基因组DNA文库(genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library) 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 1、必须有复制起点，可在适当宿主细胞中自主复制。 2 、应具有多种限制性内切酶的单一切点,以便外源 DNA能够插入。 3、应具有筛选标记,以区别阳性重组子和阴性重组 子。越直接越好。 4、 分子大小适宜，且易于分离，提纯。 5 、表达型载体应具备表达的相应调控元件。 6、 安全无致病性。 感受态：细菌处于容易吸收外源DNA的状态。 致敏过程：用理化方法诱导细胞进入感受态的操作。 导入方法： 转化 (transformation)以质粒为载体，将重组DNA导入细菌并得到表达的过程。 转染 (transfection)以噬菌体或病毒为载体将外源DNA导入真核宿主细胞的过程。 转导 (transduction)以噬菌体为媒介，将外源DNA导入细胞的过程。 转化方法 化学法：00C，CaCl2致敏 电击转化法：不需致敏，依靠短暂的电击，促使 DNA进入细菌。 收集处于对数生长期的细菌 ↓放于预冷的00C，CaCl2 溶液中作用 加入外源DNA ↓ 420C，短暂热处理（吸收DNA） ↓ 加入培养基培养后涂板 ↓ 选出转化菌落 1. 直接选择法 (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹 2. 免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等 （五）重组体的筛选 (插入失活法) 抗药性标记选择 α互补 利用α互补原理筛选重组体pUC18 原位杂交 Southern印迹 鸡的β肌球蛋白的克隆和检出 免疫学方法 重组DNA技术操作过程可形象归纳为： 小结 分 分离目的基因 切 限制酶切目的基因与载体 接 拼接重组体 转 转入受体细胞 筛 筛选重组体 重组DNA技术操作的主要步骤 载体 质粒 噬菌体 病毒 目的基因（外源基因） 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物 限制酶消化 开环载体DNA 目的基因 连接酶 重组体 转化 体外包装，转染 带重组体的宿主 筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交 表达体系的建立： 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化 （六）克隆基因的表达 （四）基因载体 定义 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA 克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为表达载体。 二、重组DNA技术基本原理 基本原理 目的基因的获取 DNA导入受体细胞 外源基因与载体的连接 克隆载体的选择和构建 重组体的筛选 克隆基因的表达 以 质 粒