第14章基因重组和基因工程.ppt

基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering 常用的工具酶 限制性核酸内切酶 逆转录酶 T4DNA连接酶 （一）目的基因的获取 化学合成法 基因组DNA文库(genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library) 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 能自主复制； 具标记，便于筛选； 有多个单一酶切位点 有一定的容量 要 求 【掌握】 1． 基因重组和重组DNA技术相关概念； 2． 重组DNA技术基本原理及操作步骤 【熟悉】。 1． 接合、转化、转导、转座作用； 2． 重组体的筛选； 3． 克隆基因的表达； 4． 基因载体的筛选； 5． DNA诊断与基因治疗。 【了解】 1． 重组DNA技术重要的工具酶； 2． 重组DNA技术与医学的关系。 Polylinker MCS: multiple cloning site Promega Invitrogen 真核表达载体示例 噬菌体 载体 粘性质粒(cosmid) 酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒） Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15oC GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 重组体 载体自连 目的基因自连 （三）基因与载体连接 单酶切克隆 双酶切克隆 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 连接 重组体 载体自连 目的基因 自连 平端连接 质粒DNA：制备感受态细菌，转入 （四）重组DNA转入宿主细胞 噬菌体DNA：包装后吸附感染细菌 病毒载体：包装后感染受体细胞 抗药性 标志补救(marker rescue) 原位杂交 免疫方法 （五）重组体的筛选 α互补 利用α互补原理筛选重组体pUC18 原位杂交 鸡的β肌球蛋白的克隆和检出 免疫学方法 （六）克隆基因的表达 原核表达体系（细菌）： 优点：培养方法简单，迅速、经济又适合大规模生产工艺，经验丰富 不足： 只用于表达cDNA 不能进行翻译后修饰 易形成不溶性包涵体 真核表达体系（酵母，昆虫细胞，哺乳细胞等）： 优点：可进行适当的修饰，蛋白可分布于胞内一定区域并积累 不足：操作麻烦，费时，不经济 基因重组 总结  二、重组DNA技术 三、重组DNA技术与 医学 一、自然界DNA重组和基因转移 内 容 一、疾病基因的发现与克隆 家族性耳聋 鼻咽癌 生物制药 生物药物现状与展望 截止到2004年2月, 美国FDA批准的生物技术药物共79种。 2005年底，美国共有1415家生物技术公司，其中329家是上市公司。全部上市公司2005年底的总市值超过4100亿美元。 2000年，在全球十大畅销药物中，生物技术药物只有安进的Epogen和强生的Procrit （epoetin alfa）。 2008年的十大畅销药物中，有5只生物技术产品（Avastin，Enbrel，Epogen/Procrit，Remicade和Rituxan）名列其中。 2014年，在前100只畅销药物中，生物技术药物所占比例将超过50%，而在 2000年和2008年时分别仅为 11%和 28% 。 发展生物制药的领域： 1 激素类： 胰岛素，生长激素 2 细胞因子： 干扰素、集落刺激因子、白细胞介素、肿瘤坏死因子、趋化因子、转化生长因子、生长因子、促红细胞生成素（EPO)等。 3 溶血栓药物： 纤溶酶原、链激酶、尿激酶、葡激酶、水蛭素等 4 血液代用品： 定型红细胞、万能型红细胞、重组血红蛋白 5 基因工程抗体： 治疗肿瘤、抗移植反应、抗病毒、抗过敏 6 重组可溶性受体： 纤溶酶原、链激酶、尿激酶、葡激酶、水蛭素等 7 病毒疫苗（亚单位疫苗和DNA疫苗）： HIV、乙肝、丙肝、戊肝、EBV，单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、轮状病毒、登革热病毒、埃博拉病毒、SARS 8 细菌疫苗： 9 寄生虫疫苗： 基因诊断(genetic diagnosis)：在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突