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第14章基因重组和基因工程.ppt

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基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering 常用的工具酶 限制性核酸内切酶 逆转录酶 T4DNA连接酶 (一)目的基因的获取 化学合成法 基因组DNA文库(genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library) 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 能自主复制; 具标记,便于筛选; 有多个单一酶切位点 有一定的容量 要 求 【掌握】 1. 基因重组和重组DNA技术相关概念; 2. 重组DNA技术基本原理及操作步骤 【熟悉】。 1. 接合、转化、转导、转座作用; 2. 重组体的筛选; 3. 克隆基因的表达; 4. 基因载体的筛选; 5. DNA诊断与基因治疗。 【了解】 1. 重组DNA技术重要的工具酶; 2. 重组DNA技术与医学的关系。 Polylinker MCS: multiple cloning site Promega Invitrogen 真核表达载体示例 噬菌体 载体 粘性质粒(cosmid) 酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 (如腺病毒,腺病毒相关病毒,逆转录病毒) Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15oC GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 重组体 载体自连 目的基因自连 (三)基因与载体连接 单酶切克隆 双酶切克隆 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 连接 重组体 载体自连 目的基因 自连 平端连接 质粒DNA:制备感受态细菌,转入 (四)重组DNA转入宿主细胞 噬菌体DNA:包装后吸附感染细菌 病毒载体:包装后感染受体细胞 抗药性 标志补救(marker rescue) 原位杂交 免疫方法 (五)重组体的筛选 α互补 利用α互补原理筛选重组体pUC18 原位杂交 鸡的β肌球蛋白的克隆和检出 免疫学方法 (六)克隆基因的表达 原核表达体系(细菌): 优点:培养方法简单,迅速、经济又适合大规模生产工艺,经验丰富 不足: 只用于表达cDNA 不能进行翻译后修饰 易形成不溶性包涵体 真核表达体系(酵母,昆虫细胞,哺乳细胞等): 优点:可进行适当的修饰,蛋白可分布于胞内一定区域并积累 不足:操作麻烦,费时,不经济 基因重组 总结 二、重组DNA技术 三、重组DNA技术与 医学 一、自然界DNA重组和基因转移 内 容 一、疾病基因的发现与克隆 家族性耳聋 鼻咽癌 生物制药 生物药物现状与展望 截止到2004年2月, 美国FDA批准的生物技术药物共79种。 2005年底,美国共有1415家生物技术公司,其中329家是上市公司。全部上市公司2005年底的总市值超过4100亿美元。 2000年,在全球十大畅销药物中,生物技术药物只有安进的Epogen和强生的Procrit (epoetin alfa)。 2008年的十大畅销药物中,有5只生物技术产品(Avastin,Enbrel,Epogen/Procrit,Remicade和Rituxan)名列其中。 2014年,在前100只畅销药物中,生物技术药物所占比例将超过50%,而在 2000年和2008年时分别仅为 11%和 28% 。 发展生物制药的领域: 1 激素类: 胰岛素,生长激素 2 细胞因子: 干扰素、集落刺激因子、白细胞介素、肿瘤坏死因子、趋化因子、转化生长因子、生长因子、促红细胞生成素(EPO)等。 3 溶血栓药物: 纤溶酶原、链激酶、尿激酶、葡激酶、水蛭素等 4 血液代用品: 定型红细胞、万能型红细胞、重组血红蛋白 5 基因工程抗体: 治疗肿瘤、抗移植反应、抗病毒、抗过敏 6 重组可溶性受体: 纤溶酶原、链激酶、尿激酶、葡激酶、水蛭素等 7 病毒疫苗(亚单位疫苗和DNA疫苗): HIV、乙肝、丙肝、戊肝、EBV,单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、轮状病毒、登革热病毒、埃博拉病毒、SARS 8 细菌疫苗: 9 寄生虫疫苗: 基因诊断(genetic diagnosis):在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突
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