第七章核酸.ppt

影响DNA Tm大小的因素： ① DNA均一性； ② G-C含量与Tm值成正比； ③ 介质中离子强度。 ① DNA均一性 均一性高，变性的温度范围越窄，据此可分析DNA的均一性 。 浓度50ug/mL时，双链 DNA A260=1.00， 完全变性（单链） A260= 1.37 当A260增加到最大值一半时， 即1.185时，对应的温度即为 Tm。DNA的Tm一般在82—95℃之间 Tm 浓度50 ug/mL时， 双链DNA A260=1.00， 完全变性（单链）A260= 1.37 当A260增加到最大增大值一半时，即1.185时，对应的温度即为Tm。 DNA的Tm一般在82—95℃之间 测定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）×2.44 ② G-C含量与Tm值成正比 离子强度高，Tm高。 ③ 介质中离子强度 当DNA的稀盐溶液加热到80-100℃时，双螺旋结构即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。 DNA变性后，它的一系列性质也随之发生变化，如紫外吸收(260 nm)值升高, 粘度降低等。 核酸的复性:变性DNA在适当的条件下（一般低于Tm 20-25℃） ，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性。 DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复。 (二) 核酸的复性(renaturation) DNA复性的程度、速率与复性过程的条件有关。 将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。但是将变性的DNA缓慢冷却时，可以复性。 分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。此外，DNA的复性也与它本身的组成和结构有关。 ★复性机制：10-20bp成拉链 ★热变性DNA在缓慢冷却时可以复性，快速冷却不能复性。 ★DNA片段越大，复性越慢； ★DNA浓度越大，复性越快。 ★复性速度可用Co·t衡量。 Co为变性DNA原始浓度mol·L-1，t为时间，以秒表示。 P352 图5-22，不同DNA的复性动力学曲线。 ●1个核苷酸对（A.U），若浓度为Co=1.0m mol/L，则 50%复性时， Cot1/2=4×10-6mol.s/L，t=0.004秒 全部复性， Cot=10-4， t=0.1秒 ●E.coli 4.2×106碱基对，若浓度Co=1.0 umol/L，则 复性50%， Cot1/2=10 mol.s/L，t=107秒，约115天。 复性100%，Cot=500 mol.s/L，t=5×108秒，5758天。 ●根据复性动力学可以测定基因组的大小和重复序列的拷贝数 (二) 核酸的复性(renaturation) 热变性的DNA单链，在复性时并不一定与同源DNA互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序列的异源DNA单链形成双螺旋结构，叫核酸杂交。 这样形成的新分子称为杂交DNA分子。DNA单链与互补的RNA链之间也可以发生杂交。 核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。 (三) 核酸的杂交(hybridization) (三) 核酸的杂交 核酸杂交 Southern blotting （Southern印迹法）： DNA-DNA杂交 Northern blotting （Northern印迹法）： DNA-RNA杂交 Western blotting （Western印迹法）： 抗原-抗体结合 Southern Blotting DNA样品 → 酶切 → 电泳 → 碱变性 → 转膜 → 固定 → 杂交 → 洗涤 → 放射自显影 变性（NaOH 0.5mol/L） 转膜（NC膜，尼龙膜） 固定（80℃，4-6h） 杂交（高盐浓度，68℃，几小时） Southern Blotting可用于DNA之间同源性分析，确定特异性DNA序列的大小和定位。 Northern Blotting 研究对象是mRNA，探针一般是DNA。 总RNA或mRNA需在变性条件下电泳 （乙二醛、甲醛） Western Blotting 抗原与抗体的杂交 研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术。 六、核酸的凝胶电泳 1、 琼脂糖凝胶电泳： 分析分子量大于1000bp的DNA片段 2、 聚丙烯酰胺凝胶电泳：分析分子量小于1000bp的DNA片段 七、DNA的固相合成 520页 八、DNA的限制酶图谱 限制性内切酶 来源于细菌，高度专一地识别外源DNA上的特定位点，并将其切断，形成形成粘性末端或平齐末端。不降解自身细胞的DNA。因为在自身相应位点上经甲基化修饰而受到保护。 DNA的限制性内切酶图谱 何叫回文结构？ A—T—C—G—A—T—C—G—A—T—C—G—