第三章细胞生物学研究方法-12.ppt

第三章 细胞生物学研究方法 第一节 细胞形态结构的观察方法 第二节 细胞组分的分析方法 第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术 第一节 细胞形态结构的观察方法 一、光学显微镜技术 (light microscopy) 二、电子显微镜技术 (Electro microscopy) 三、扫描遂道显微镜 (Scanning tunneling microscope,STM ) (一)普通复式光学显微镜技术 （二）相差和微分干涉显微镜技术 相差显微镜（phase contrast microscope）： 1932年P．Zernike发明，1953年,诺贝尔物理奖。 最大特点：可以观察未经染色的标本和活细胞。 基本原理：把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。 ?相差显微镜与普通光学显微镜不同之处： 1.环形光阑(annular? diaphragm):位于光源与聚光器之间。 作用:使透过聚光器的光线形成空心光锥,焦聚到标本上。 2.相位板(annular phaseplate):在物镜中加涂有氟化镁的相位板，将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。 A+相板：将直射光推迟1/4λ，两组光波合轴后光波相 加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变 亮，形成亮反差（或称负反差）。 B+相板：将衍射光推迟1/4λ，两组光线合轴后光波相 减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差）， 结构比周围介质更加变暗。 微分干涉显微镜（differential interference microscope ） 1952年，Nomarski发明，适于研究活细胞中较大的细胞器。 优点:能显示结构的三维立体投影影像，立体感特别强，适合于显微操作(基因注入、核移植、转基因)。 原理:利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果能显示结构的三维立体投影。标本可厚一点，折射率差别更大，故影像立体感更强。 录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy） 　计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活细胞中的颗粒细胞器的运动。 (三)荧光显微镜技术(Fluorescence Microscopy) 原理与应用： 利用较短波长的光使样品受到激火，产生较长 波长的荧光，可作观察和分辩样品中产生荧光 物质的成分和位置。 包括：直接荧光标记技术;间接免疫荧光标记技术 在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性 定位：如绿色荧光蛋白(GFP)的应用? (四)激光共焦扫描显微镜技术（Laser  Scanning Confocal Microscopy ） ?原理与应用： 利用共焦光路和激光扫描技术获取生物样品不同层面的图像，再通过计算机组合成三维重构的影像。 排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率(1.4—1.7倍)，可重构样品的三维结构。 二、 电子显微镜技术 （一）电子显微镜的基本知识 3.电子显微镜的基本结构 （二）主要电镜制样技术 负染色技术（Negative staining）： 负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。 快速冷冻深度蚀刻技术（quick freeze deep etching） 4. 电镜三维重构技术 电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结 合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。 电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核 磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学 （Structural Biology） 主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的 主要实验手段 5. 扫描电镜技术 扫描电镜(Scanning electron microscope，SEM) 三、 扫描遂道显微镜 （Scanning tunneling Microscope,STM） 第二节　细胞组分的分析方法 一、离心技术 用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物 差速离心(differential centrifugation):利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种亚组分和颗粒分开。 密度梯度离心(density centrifugation):不同组分以不同有沉降速率沉降，形成不同的沉降带。 沉降速率与物质的形态和大小有关，以沉降系数(S值