03第三章细胞生物学研究方法2013.ppt
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*;*;*;*;两束光波之间的相互干涉;*;*;*;*;*;*;*;冷冻蚀刻技术;扫描电镜技术;*;*;小结;单词;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*
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第三章 细胞生物学研究方法;;2、原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。;普通光学显微镜光路图;3、主要的性能参数; ——sinα/2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为0.05～0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。
——普通光线的波长为400 ～ 700nm，分辨力数值不会小于0.2μm，人眼的分辨力为0.2mm,因此显微镜的最大设计倍数为1000X。;5、观察标本的制备：;第一步. 固定(fixation)
目的：使大分子交联而保持固定，不至在后面过程中移位或丢失。
试剂：甲醛、戊二醛
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第三章 细胞生物学研究方法.doc
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一、章（节、目）授课计划 第 页
授课章节名称
第三章 细胞生物学研究方法
授课
时数
2
教
学
目
的
1、使学生掌握细胞形态结构的观察方法，了解主要工具，侧重掌握基本原理和基本应用
2、了解细胞组分的分析方法及细胞培养
3、了解细胞工程技术
教
学
要
求
1、掌握细胞形态结构的观察方法，掌握光学显微镜技术 2、了解细胞组分的分析方法及细胞培养
3、了解细胞工程技术
教
学
重
点
1、细胞形态结构的观察方法
2、细胞组分的分析方法及细胞培养。
教
学
难
点
1、观察细胞形态的主要方法及工具的介绍。
2、细胞组分的分析方法
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* Xenopus Melanophore： 非洲爪蟾蜍黑素细胞 负染色? 研究以蛋白质为主要成分的颗粒状材料的最常用方法。以某些在电子束轰击下稳定而又不与蛋白质相结合的重金属盐类作为负染色剂，使之在支持膜上将颗粒材料包围，形成具有高电子散射能力的背景，衬托出低电子散射能力的颗粒的形态细节。其所成的电子显微像的反差与常规电子染色相反，即暗的背景和亮的颗粒形态的所谓阴性反差。负染色方法简便，所获得的颗粒的电子显微图像反差强,分辨率也高于超薄切片,可广泛用于研究蛋白质分子、细菌鞭毛、蛋白质结晶，以及生物膜及分离的细胞的细微结构，特别适用于蛋白质大分子及病毒颗粒结构的三维重建研究。常用的负染色剂有
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生物学研究模式生物 Caenorhabditis elegans Drosophila melanogaster Arabidopsis thaliana 对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈 细胞实验安排 3-11周 各班分两个组，选出组长 星期二 5-8节 星期四 6-9节 由代老师和周毓老师指导 实验目录见文档，发至吴烈华处，互相传。 快速、灵敏、有特异性 * c 第三章 细胞生物学研究方法 细胞形态结构的观察方法 细胞组分的分析方法 细胞培养、细胞工程与显微操作技术 第二节 细胞组分的分析方法 ? 细胞组分：细胞器、生物大分子（蛋白、核酸） 细胞组分的分离技术
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* * * * * * * * * * * * * * * * 纤维素酶核磁共振分析结果(A)及三维结构(B) 退 出 Technology for Cell Biology 首 页 第三章 细胞生物学研究方法 二、X-射线衍射技术 单个物体受到波长比自身小的电磁射线照射，会散射一部分射线，射线的光波相互重叠干涉，物体向各方向散射的射线量可被记录为X-射线衍射图(diffraction pattern)。 亮点的强度取决于晶格排列物体的内部构造。 亮点的位置取决于晶格排列物体的排列方式。 应用：从蛋白质结晶衍射图中计算出精确的微细结构， 目前是确定分子中原
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第三章 细胞生物学研究方法 第一节 细胞形态结构的观察方法 第二节 细胞组分的分析方法 第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术 第一节 细胞形态结构的观察方法 一、光学显微镜技术 (light microscopy) 二、电子显微镜技术 (Electro microscopy) 三、扫描遂道显微镜 (Scanning tunneling microscope,STM ) (一)普通复式光学显微镜技术 （二）相差和微分干涉显微镜技术 相差显微镜（phase contrast microscope）： 1932年P．Z
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第三章 细胞生物学研究方法 本章主要介绍细胞形态结构的观察方法、细胞组分的分析方法、以及细胞培养和细胞工程方面的技术与研究。 考点分析 本章主要考查各类方法技术的原理及用途,考查形式多样。 光学显微镜技术主要考查分辨率及其影响因素,各种特殊显微镜的基本特点及应用范围. 电子显微镜技术则在设计原理及类型、样品制备技术（超薄切片、负染色、冰冻蚀刻、免疫电镜技术）的原理及应用方面以简答题形式为主。 考点分析 细胞内各种化学成分的定性、定位和定量分析技术、细胞化学与组织化学法、免疫细胞化学法、各种分光光度术、放射自显影和分子杂交技术等，考查的形式多以实验设计为主进行考查。 目录 第一节 细胞形态结
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第三章 细胞生物学研究方法 研究技术、研究工具 显微镜的出现——细胞学说的建立 电子显微镜技术——进入超微与分子形态水平 超离心技术 细胞成分、代谢过程的 同位素示踪技术 精确定性、定量分析 单克隆抗体、分子杂交——生物工程 第一节 细胞形态结构的观察方法 一、光学显微镜技术 二、电子显微镜技术 三、扫描隧道显微镜 一、光学显微镜技术 1、普通复式光学显微镜技术 2、荧光显微镜技术 3、激光共焦点扫描显微镜技术 4、相差显微镜技术 1、普通复式光学显微镜技术 1）光学显微镜的组成 2）分辨率 指区分开两个质点间的最小距离。 2、荧光显
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第三章 细胞生物学研究方法 1974年Steffensen等从HeLa细胞的多核糖体中分离出5SrRNA，并以125I标记制成探针，并测探出5SrRNA的基因在染色体上的位置。 具体过程是这样的，首先对载片上的人体细胞中期染色体进行原位变性，并加入探针，这时，探针只能和产生它的模板DNA互补，即进行分子杂交，而其他部位则不行。放射自显影暴露二个月后，发现在所有制片的染色体组中，一对一号染色体均被标记，标记的位置是短臂末端，这说明5SrRNA基因位于第一号染色体的短臂末端。 原位杂交技术首先是在光镜水平上发展起来的。 近年来随着免疫电镜技术的不断进步， 电镜原位杂交技术也得到了发展。 电镜原
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由能进行无限次传代培养的细胞群称为细胞系。细胞系细胞与体内原来的细胞比，其形态、结构、遗传上存在不同程度的变异。 细胞系（cell line）： 细胞系细胞的特点是染色体明显改变，一般呈亚二倍体或非整倍体，接触抑制丧失，容易传代培养。如Hela细胞系、BHK21细胞系、CHO细胞系等。 Hela细胞（左）、CHO细胞（右）的培养 1、贴附型细胞 （1）成纤维细胞型细胞 细胞长梭形,核圆位中央,胞质常外伸2-3个长短突起,多数细胞排列疏散,有较大细胞间隙,有时也相互平行排列，成群细胞呈放射状、旋涡状等形式。 （2）上皮型细胞 类似
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五、放射自显影技术 ?原理及应用： ?利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究； ?实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。 ?步骤： ?前体物掺入细胞（标记：持续标记和脉冲标记） ———放射自显影 六．定量细胞化学分析技术 ? 细胞显微分光光度术（microspectrophotometry） ?利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质 （如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。 包括： 紫外光显微分光光度测定法 可见光显微分光光度测定法 ? 流式细胞仪（Flow Cytometry） ?主要应用：
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一、离心技术
• 是分离细胞器及各种大分子基本手段。
第二章 细胞组分的分析方法 • 转速为10~25kr/min的离心机称为高速离心
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第三章细胞生物学研究方法 目录 第一节 细胞形态结构的观察方法 第二节 细胞及其组分的分析方法 第三节 细胞培养与细胞工程 第四节 细胞及生物大分子的动态变化 第五节 模式生物与功能基因组的研究 第一节 细胞形态结构的观察方法 光学显微镜 包括：普通复式光学显微镜、相差和微分干涉显微镜、荧光显微镜、激光扫描共焦显微镜。 电子显微镜 包括：透射电子显微、扫描电子显微镜。 光学显微镜 1．普通光学显微镜 (1) 结构： ①照明系统(光源,聚光镜) ②光学放大系统(主体) （物镜、目镜） ③镜架及样