第九章植物基因的遗传转化.ppt

第九章 植物基因的遗传转化 第一节 DNA直接导入基因转化 第二节 种质系统介导基因转化 第三节 农杆菌介导的基因转化 第四节 植物基因转化系统的选择策略 第一节 DNA直接导入基因转化 一、化学诱导DNA的直接转化 PEG介导基因转化 二、物理诱导DNA直接转化 基因枪法介导基因转化 电击法介导基因转化 DNA直接导入转化就是不依赖农杆菌载体和其他生物媒体，将特殊处理的裸露DNA直接导入植物细胞，实现基因转化的技术。（又成无载体DNA介导转化） DNA直接转化技术根据其原理可分为化学法和物理法两类。 一、PEG介导基因转化 化学诱导DNA直接转化是以原生质体为受体，借助特定的化学物诱导DNA直接导入植物细胞的方法。 PEG介导基因转化是Davey等（1980）和Krens等（1985）首先建立的。 一）原理 化合物聚乙二醇（PEG）、磷酸钙及高PH值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子。 PEG是细胞融合剂，可以使细胞膜之间或使DNA与膜形成分子桥，促使相互间的接触和粘连，且可引起膜表面电荷的紊乱，干扰细胞间识别，有利于细胞膜间的融合和外源DNA进入原生质体。 二）步骤 质粒DNA的提取（可以是Ti质粒，也可直接提取某一植物的DNA作目的基因）； 原生质体的分离； 转化培养：将新制备的原生质体悬浮液与质粒DNA保温培养，同时加入PEG，在PH8－9下促进原生质体摄取DNA，使细胞转化；转化培养同时加入运载DNA，即鲑鱼精DNA促进转化； 离心收集原生质体； 将原生质体按一般方法培养，当细胞团长到一定大小时，将细胞团转移至含选择压力的培养基种筛选转化细胞。 三）转化率及影响因素 PEG诱导直接基因转化方法获得的转化率很低，约10－5－10－6。主要因为原生质体培养本身成功率很低。 影响转化率的因素： 加入DNA与PEG的次序明显影响转化率，DNA应在PEG处理前加入； 加入PEG，其最终浓度一般需20%; 用含MgCl2的溶液或CaCl2处理原生质体能显著提高转化率； DNA构象对转化率有很重要影响，线性DNA比环形DNA对植物细胞的转化更有效； 加入携带DNA能提高转化效率，如鲑鱼精DNA； 在细胞周期的S期或M期时的转化率明显高于其它时期，可以用2、4－二氯甲晴处理，使细胞进入S期和M期，提高转化率 在PEG处理前，用低剂量x射线或紫外线处理原生质体，可使更多的细胞有效地整合外源基因； 外源DNA的浓度对转化的影响：在一定DNA浓度范围内（10－60ug/ml），转化率随DNA浓度增加而递增； 原生质体的浓度的影响：原生质体1.0x106个/ml比较好； PH值对PEG转化的影响；当PH5.8-6.0时，转化处理后的原生质体分散性好，转化率高。 四）特点 原生质体本身具有摄取外来物质的特性，PEG法是利用生物生理功能来实现外源基因的导入，对细胞的伤害小； PEG法获得的转化再生植株来自一个原生质体，可以避免嵌合转化体的产生。 PEG法转化的原生质体易于选择转化体； 受体材料不受种类的限制，只要能建立原生质体再生系统的植物都可以采用此法； 困难： 建立原生质体再生系统困难，阻碍了PEG的应用； 转化效率低； 从原生质体再生的无性系植株变异较大。 二）电击法介导基因转化 物理方法是基于许多物理因素对细胞膜的影响，或通过机械损失直接将外源DNA导入细胞。可以原生质体为受体，也可直接以植物细胞乃至组织、器官为受体，比化学法更具广泛性和实用性。 1985年李宝健等首先将电击法用于植物细胞的基因转化，该法在禾谷类作物种更有发展潜力。 原理：利用高压电脉冲作用在原生质体膜上电击穿孔，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄取。 分离的原生质体加入电击缓冲液，将原生质体密度调节到1x106－2x106个/ml； 加入质粒DNA(10ug/ml)和鲑鱼精DNA（50ug/ml），混合后分装于电击反应槽内； 冰浴10min； 600r/min离心3min除去电击缓冲液，用液体培养基洗涤； 将原生质体包埋于固体培养基中，28度黑暗调节下选择培养。 二）转化率及影响因素 电击法的转化率可达1.2% 影响因素： 电击的处理方式对转化率有决定性作用，一般采用高电压、短时间(1-1.25kv/cm, 10s)处理比较好; 使用的电场强度、波形及处理时间对转化率有极为重要影响，在一定范围，增加场强，延长脉冲持续时间能提高转化率。 在电击处理时，有PEG存在对转化率有重要促进作用； 加入运载DNA可以提高转化率； 原生质体所处的介质成分也会影响转化率，原生质体应悬浮在便于进行电击的具有特定电阻的盐溶液中； 其它因