原位杂交手册.doc
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第1章 共用程序
引 言:
本章介绍了本实验最基本的实验程序,包括中期染色体制片;质粒的转化与DNA的提取;探针标记检测以及基因组总DNA的提取
第1节 原生质体染色体制片
试 剂:
饱和a-溴萘、0.075MKCl、固定液(新鲜3:1甲醇冰乙酸)、酶解液(20%纤维+2%果胶酶)、IN HCl、95%酒精
实验步骤:
浸 种 室温下浸种约一天(也可1-2h)
发 芽 培养皿中垫湿滤纸三层,利子分散其上,间留间隔,勿堆积,种子上层覆盖一层水浸湿的滤纸,25-30℃下发芽,每天水洗一两次,约2-3天可取根。
NOTE:换水是很重要的,水不能过多,以不留流动水为好,水分过多易长芽而根长不好。
预处理
方法1:根长至1.5-2cm长时切取1.5mm 左右的根尖,饱和a-溴萘约25℃处理2-3小时,水稻一般不预处理。
方法2:根长好后将种子置于4℃冰箱处理一个晚上,第二天在25℃下恢复2-3h,也可得到许多分裂相。
NOTE:何进取根尖最好具随机性,与季节以及细胞分裂时期很有关系。(玉米8:00AM,水稻11:00-12:00AM)
水 洗 反复几次
前低渗 ddH2O或0.075M KCl(0.6KCl溶于100ml ddH2O)低渗30min(室温)。
固 定 新鲜3∶1甲醇冰乙酸固定2-3小时或4℃过夜。
NOTE:一定要用新鲜固定液;如果用于石蜡切片组化显色,甲醇固定的材料会导致很高背景,应换用4%多聚甲醛。
水 洗 反复几次,洗净。
酶 解 2%纤维素酶+2%果胶酶混合(1∶1),28℃下处理3小时左右。
NOTE:酶解是最至关重要的一步,首先是酶的质量,很多酶都可导致分裂相少,以SERVA公司的果胶酶为最好,根据材料不同,酶解时间会有所变化。
洗载片 载片一定要干净,以防材料脱落和保持清洁的背景。
洗片步骤:
1)IN HCl中3min以上
2)自来水洗(每片单独漂洗)接着用双蒸水洗
3)95%酒精浸泡30min以上(每片单独放入)
制 片 小心吸去酶液,水洗几次,吸取1-2个根尖于干净的干载玻片上,滴半滴固定液,用镊子敲至浆状,滴2-3滴固定液使材料分散,火烤至着火。
NOTE:敲得越碎越好,敲至固定液干后,再滴固定液,迅速涂开,火焰干燥,干燥后肉眼观察应为规则干净的小雨点状,若小雨点上像有一层不透明的薄层,说明酶解时间不够。
镜 检 检后将符合要求的制片储存于-20℃下备用。
NOTE:每张制片上至少应有150个左右分散良好但背景干净的分裂相方可用于杂交。
REFERENCES
第2节 质粒的转化与扩增
若寄来的探针是插在质粒中cDNA克隆或基因片段,首先要对其进行转化,一般利用E.Coli 作为载体,转化的关键在于如何制备感受态的 E.Coli细胞,本实验利用 CaCl2来制备感受态细胞,此方法简便、快速。
试 剂:
LB培养基,0.1M Cacl2,70%甘油
实验步骤:
感受态E.Coli的制备
从-20℃下取2-5μl E.Coli,涂在平板上,37℃培养16-20h。
挑取单个菌落于20ml已预热至37℃的LB培养基(不含Amp)中,37℃,300rpm剧烈振摇约3h。
培养物转移至4支预冷的5ml Eppendorf管,冰上放10min,4000rpm离心 3-5min,回收细胞(4℃); 倒出培养液,倒置lmin。
以5ml预冷的0.1M Cacl2重悬每份沉淀,冰浴30min。
4000rpm离心5min(4℃);倒出培养液,倒置lmin。
每管加预冷的0.1MCaCl2 0.25ml,重悬细胞,冰浴lh
每管100μl分装,保存于-20℃下,长期保存转化效率会有所下降。
质粒DNA的转化
取-20℃保存的感受态细胞二支,冰上溶解10min,一支加质粒cDNA(10μl,30ng),混匀,另一支作为对照,冰浴30min。
42℃水浴放置90秒,保持1-2min。
快速置于冰浴,保持1-2min。
每管加200-300μl培养基,用水浴加热至37℃ 。
37℃摇床温育45min。
扩 增(无菌操作)
将温育后的转化细胞转移至含抗生素(100μg/ml LB)的LB平板上。
当液体被培养其吸收后,倒置平板,37℃培养12-16h,时间不宜过长。
菌落生成后,挑取单个菌落,37℃于LB液体培养基中培养24h左右。
加70%甘油,-20℃保存。
第3节 质粒DNA的提取
试 剂:
LB固体培养基,LB培养基,Sol.Ⅰ,Sol.Ⅱ(当配当用),Sol.Ⅲ,Sol.VI,异丙醇,70%酒精,RNaseA,100%EtOH,TE溶液
实验步骤:
活 化 含重组质粒细菌用划线法接种在LB固体培养基上,37℃培养箱培养过夜。
扩 增 挑
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