荧光原位杂交实验.ppt

第1页，共35页，星期日，2025年，2月5日原位杂交(Insituhybridization)

1）同位素原位杂交(Isotopicinsituhybridization)

——70年代

2）非同位素原位杂交(Non-isotopicinsituhybridization)

——80年代中后期

（1）免疫酶联

（2）荧光原位杂交（Fluorescenceinsituhybridization,FISH)

**同位素原位杂交的不足之处：

1）不稳定；

2）高背景；

3）曝光时间长；

4）结果统计学处理繁琐。5）同位素的使用和处理

第2页，共35页，星期日，2025年，2月5日实验的基本原理:FISHisthedetectionofhighlyspecificDNAprobeswhichhavebeenhybridizedtoeitherinterphaseormetaphasechromosomesusingfluorescencemicroscopy.

第3页，共35页，星期日，2025年，2月5日DNAforprobeuseislabeledwithfluorescent(directmethod)ornonfluorescentmoleculeswhicharethendetectedbyfluorescentantibodies(indirectmethod).Theprobesbindtoaspecificregionorregionsonthetargetchromosome.Thechromosomesarethenstainedusingacontrastingcolor,andthecellsareviewedusingafluorescencemicroscope.

第4页，共35页，星期日，2025年，2月5日第5页，共35页，星期日，2025年，2月5日第6页，共35页，星期日，2025年，2月5日第7页，共35页，星期日，2025年，2月5日**荧光原位杂交的特点：

1）快速；2）信号强；3）特异性高；4）多色。

**FISH有上述优点的原因：

使用了荧光标记与检测系统取代放射性标记与检测系统

标记探针的物质：（1）生物素(biotin)/地高辛(digoxigenin)

——半抗原报告分子（间接标记）

（2）荧光物质（直接标记）

第8页，共35页，星期日，2025年，2月5日FLUORESCENTlabeleddUTPHAPTENElabeleddUTPAMCA-6-dUTPCascadeBlue-4-dUTPFluorescein-12-dUTPRhodamine-6-dUTPTexasRed-6-dUTPCy3-6-dUTPCy5-dUTPBiotin(BIO)-11-dUTPDigoxygenin(DIG)-11-dUTPDinitrophenyl(DNP)-11-dUTP第9页，共35页，星期日，2025年，2月5日染色体复染的物质:

PropidiumIodide(PI)（红色）DAPI（兰色）quinacrine（绿色）chromomycineA3（绿色）

第10页，共35页，星期日，2025年，2月5日第11页，共35页，星期日，2025年，2月5日染色体“原位抑制”杂交（chromosomeinsitusuppression,CISS)

克服散在的重复序列造成的杂交背景，提高信号的特异性，在探针中加入过量的未标记的竞争性DNA(competitorDNA)，如humanCot-1DNA，进行杂交前的预复性。探针中的重复序列与加入的竞争物中的大量重复序列优先复性，而特异性的单拷贝序列因竞争物中同源序列拷贝数少，绝大部分仍保持单链状态。

**FISH技术的应用

1）基因（或DNA片段）的染色体定位；

2）染色体数目与结构异常的检测；

3）间期细胞遗传学（绒毛/羊水/精子/卵裂球/其它间期细胞研究与诊断）；

4）肿瘤遗传学研究第12页，共35页，星期日，2025年，2月5日**用于FISH的探针

1）单拷贝探针：

（1）种类：YAC，BA