双向荧光原位杂交手册(2_dimensionFISH_protocol).doc

组织（细胞）间期核2-dimension DNA FISH实验步骤 Note：依照本protocol 进行该实验两大关键因素： 一是样品玻片的制备，包括细胞核释放的多少，点片的细胞密度，玻片背景的干净与否，溶液的新鲜程度，蛋白酶消化的时间等； 二是BAC探针的制备纯化，包括BAC的纯度，探针的质量，不同探针的比例，与样品孵育的时间等；另外，温度，湿度，光照也要严格按要求进行。 一、组织间期核制备过程 组织放入平皿中，加含50ul双抗的PBS 5ml泡10min。 用PBS洗一下，剪碎。 加胶原酶5ul和培养液5ml放入37度过夜。（该步骤只针对不易释放游离细胞的组织） ——过夜消化则以上操作均需在超净台进行，以防污染 （细胞：PBS洗两遍，消化细胞，收集，PBS洗一遍，细胞数太少则不洗）。 4. 将组织碎块（细胞）在15ml离心管中加0.075M KCL 10ml，37 ℃ 水浴锅内低渗30min。 取出加固定液（甲醇：冰醋酸=3：1）2-3滴混匀，室温1000rpm离心10min弃上清。 加固定液10ml混匀后，室温静置30min，离心弃上清。 步骤6重复三次后加入固定液1.5ml，混匀后静置1~2min，将上层较为清亮的细胞悬液约1ml转于1.5 ml EP管内4℃存放。（长期可置-20℃冻存） 点片：将适当细胞密度的悬液0.2-1μl点于玻片上，用钻石笔在玻片背面划出范围，室温过夜。 二、荧光探针的标记（随机引物） 1. 预变性( PCR仪) template DNA (ds DNA) 200ng 2.5 x Kenelow buffer (invitrogen) 10μl ddH2O --------------------------------------------------- Σ 12.5μl 95℃ 10min 2. 取出PCR管, 立即放冰上1~2 min 3. 室温加缺T的dNTP (A/C/G : T= 0.5 : 0.25), 各管加4μl 4. 快速各加8μl所要标记的荧光素(eg.Cy3-dUTP)，马上避光 5. 再各加0.5μlKenelow酶，混匀后轻微离心一下（甩一下即可），37℃避光过夜（16小时以上），此时PCR管内溶液的总体积为25μl。 6.第二天加2.5μl stop buffer混匀，瞬时离心后4℃ 避光存放。 三、Fluorescence in situ hybridization (直接标记) 注意：73℃水浴锅应在实验前开始调温度开关键，立式染缸应在40℃前放入水浴锅，否则易使染缸破裂。 （一）、前期处理 玻片的处理 10μg/μl RNase1.0 μl现配1：100溶于2 X SSC 99 μl, 37℃ 消化40min (将2 X SSC加到PCR管中再将RNase加到2 X SSC中，混匀，用移液枪将混匀的液体吸起再加到载玻片的染色体上，再剪下PE手套，展开成适当大小的薄膜覆盖在印迹上，避免液体蒸发，放37℃的湿盒中40min) 2 X SSC 3min X 2 (揭开薄膜将玻片放在2 X SSC的染缸A中，3 min后取出将玻片下沿挂的液珠放在几层的卫生纸上吸干，再放在2 X SSC染缸B中3min 取出，再按照上述的方法吸干液珠，依次放入75%、85%、100%的乙醇2min X 3次，晾干 蛋白酶消化吸取60μl 1 X Pepsin加到玻片的印迹上，用PE做成的薄膜覆盖在上面，37℃温箱中放 (在加pep前，先要混匀)。 1 X PBS5min 固定 (取出玻片，放入1%的多聚甲醛的立式染缸里，10min) V1= Va+Vb Cot-1 (封闭中度重复序列) V2= (1-2倍V1 ) SS DNA(封闭高度重复序列) V5=1/10 (V1+V2+V5+V6) 5μl ddH2O V6=50μl -(V1+V2+V5) Σ V1+V2+V5+V6 50μl NaAc (3mol/l) (沉淀探针) V3=1/10 (V1+V2+V5+V6) 5μl 100%乙醇 (-20℃) V4=2 X (V1+V2+V3+V5+V6) 110μl 在PCR管内混匀 (以上混合液放在纸盒内，不停的转动，以使混合液混匀) 出现白色沉淀 -80℃，30min-12h 注意：有时还需加鲑鱼精 (SS DNA)： 5μl (封闭高度重复序列，13、14、15、21、22号染色体有随体DNA即有高度重复序列) 12000rpm，4℃，10min，去上清 加适量的-20℃预冷75%乙醇，12000rpm，4℃， 5min 注：这次要用TIP头在管壁划几圈，目的使粘附在管壁上的