生物化学与分子生物学试验基本理论分光光度技术利用紫外光.DOC

生物化学与分子生物学 实验基本理论 一、 分光光度技术 利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法，称为分光光度法或分光光度技术，使用的仪器称为分光光度计，这种分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广，其中的紫外／可见分光光度技术更是生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一。因此重点讨论紫外／可见分光光度技术的基本原理、仪器构造及其在生化领域中的应用等。 基本原理 光线是高速运动的光子流，也是具有波长和频率特征的电磁波。光子的能量与频率成正比，与波长成反比。肉眼可见的光线称为可见光。可见光只占电磁波谱的很窄部分(400nm～760nm)。不同波长的可见光具有不同的颜色。波长大于760nm的光线称为红外线。波长小于400nm的光线称为紫外线。 当一束白光通过一杯有颜色的溶液时，具有一定波长的光线选择性的被溶液所吸收。不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力不同，因此每种物质都具有其特异的吸收光谱。吸收光谱的测定可以用来鉴定各种不同的物质。例如核黄素之所以呈现黄色，是由于它仅吸收可见光中的蓝光范围，并测得其吸收峰在450nm（图3-1-1）。 （核黄素22(mol/L溶于 0.1mol/L 磷酸钠中， pH7.06，吸收杯厚1cm） 在紫外光范围它还有两个吸收峰。它们分别是260nm和370nm。分光光度法常被用来测定溶液中存在的光吸收物质的浓度。其理论依据是郎伯—比尔(Lambert-Beer)定律。 （一）郎伯定律(Lambert’s Law) 一束单色光在通过一溶液时，由于溶液吸收一部分光能，使光的强度减弱。若溶液的浓度不变，则溶液的厚度愈大，光强度的减弱也愈显著(图3-1-2) 若I0表示入射光强度，I表示光线通过溶液后的强度，L表示溶液的厚度。 则 －d I ＝αI, 　　－ d I ＝αI, 或 d I ＝αd L d L d L I 积分：∫ d I ＝－∫αd L I 得：InI=－αL＋C 当Ｉ=0时，I=I0，所以C=InI0 ，即 InI=－αL＋InI0 所以 In I0 ＝αL 或 I ＝e-αL I I0 或 Log I0 ＝K1L (K= α ), I ＝10-K1L I 2.303 I0 K1是一常数，受光线波长、溶液性质和溶液浓度影响。从上述公式可知，透过溶液后，光强度的减弱（I/I0）与溶液厚度（L）呈指数函数关系。可见光强度的改变与溶液厚度并不呈简单的正比关系，这一关系就是郎伯定律。 （二）比尔定律(Beer’s Law) 当一束单色光通过一溶液时，若溶液的厚度不变，则溶液浓度愈高，光线强度减弱也愈显著，与上定律相似。两者的关系可以表示如下： Log I0 ＝K2C, 或 I =10-K2C I I0 其中，C表示溶液的浓度。K2是一常数，受光线波长、溶液性质和溶液厚度的影响。上述公式所表示的光强度与溶液浓度的关系称为比尔定律。 虽然所有的溶液均符合郎伯定律，但并非所有的溶液都符合比尔定律。这是由于有些物质在不同浓度条件下其颜色可能发生改变，即在不同浓度条件下其吸收光的波长发生改变。常见的原因如下： 1．有些有色物质在溶液中可能解离成相应的离子，离子的颜色与分子的颜色不同，造成对比尔定律的误差。 2．有些物质在较高浓度状态下可形成络合物，络合物使吸收光谱发生改变。例如：氯化钴在稀溶液中呈玫瑰色，而在浓溶液中呈蓝色。 CoCl2 + CoCl2→Co2+ (CoCl4)2- 玫瑰色 蓝色 3．氢离子浓度和电解质也可引起一些有色物质颜色的改变，这些改变也可能造成对比尔定律的误差。 （三）郎伯——比尔定律及其应用 Log I ＝-KCL 或 I =10-KCL Io Io 一般将通过溶液后的光线强度（I）和入射光（Io）的比值称为透光度(transmittance, T)，将-Log 用光密度(Optical density, O.D.或D)表示，以反映该溶液对光吸收的情况。有时也用吸光度(absorbance, A)表示。则它们之间的关系如下： A（D）=－Log I ＝－LogＴ ＝ＥＣＬ (1) I0 其中，Ｅ为消光系数(Extinction coefficient), 表示物质对光线吸收的本领，其值因物质种类和光线波长而异。 从公式（1）可知对于相同物质和相同波长的单色光（消光系数不变）来说，溶液的光