4thday质粒的提取与电泳.ppt

质粒DNA与基因组DNA的区别 （7） 12,000 转/分离心8min。 弃上清，室温干燥质粒DNA 5-10min。 （去除RNA） （8）用20?l含RNase的水溶解质粒DNA， 轻轻吹打混合。 37 ℃保温10min * * 上次实验小结 1、观察自己组的实验结果：转化平板 *培养板在37C 培养12-16h 卫星菌：培养时间过长 2、实验中的难点 *制备效率高的感受态细胞 o 目的 DNA片段 质粒 TA载体 连接 重组质粒 目的 DNA 转化 无质粒的E.Coli 死亡 有质粒的E.Coli 存活 含抗生素培养基中生长 重组质粒的鉴定 PCR 开始上课时介绍2-3min 平板筛选 小量制备质粒和电泳分析 实验四 开始实验操作前：本次实验介绍10-15min 质粒…… 质粒载体 是存在于细菌染色体外的小型闭合环状双链DNA分子，在宿主细胞内可独立自主复制并赋予宿主细胞一定的遗传性状 筛选标记 MCS（多克隆位点） 复制原点 质粒 1)培养细菌使质粒扩增； 2)收集裂解细菌； 3)分离纯化质粒DNA。 质粒提取原理： 质粒提取有多种方法，但都包含有3个基本步骤： √去除蛋白质 √去除基因组DNA √去除RNA *酚-氯仿抽提法 *RNase消化 ？？？ 大肠杆菌遗传物质 1、部位不同： 2、大小不同： 质粒分子量较小，大小只有普通细菌染色体DNA的百分之一。 基因组DNA分子量较大，细菌基因组约含3000个基因，5?106 bp。 基因组DNA容易断裂线性化 碱裂解法提取质粒的原理 原理： 1、强碱和SDS裂解细菌，细菌中的质粒或基因组DNA在碱性条件下发生变性。 2、怎样去除基因组DNA？ 当加入酸性物质进行中和时，质粒DNA很快复性， 染色体DNA则和变性蛋白质等缠绕在一起难以复性而形成沉淀，经离心随细胞碎片一起去除； 3、怎样去除蛋白质？ （已经学过） 留有质粒DNA的上清，经酚和氯仿去除蛋白质后, 用乙醇沉淀质粒DNA，即得到质粒DNA. 1) 细胞悬浮液（溶液I）--悬浮菌体 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris.Hcl PH 8.0 10 mmol/L EDTA.Na2 PH 8.0 2) 细菌裂解液（溶液II） --裂解菌体 0.2mol/L NaOH 1% SDS 碱裂解法提取质粒试剂： 3）中和液（溶液III） ----中和NaOH 60 ml 5mol/L 醋酸钾 11.5ml 冰醋酸 28.5ml 水 4）20mg/ml RNase----降解细菌RNA 工作浓度30～50 ? g/ml 其他试剂作用和成分同实验一。 质粒DNA的制备 录像5分钟：（8：20~8：25） （1）（细菌的收获：） 取1.5 ml 工程菌液6,000转/分，离心2min， 弃上清。 （2）（细菌的裂解：） 加入200?l预冷的细胞悬浮液（溶液I）悬浮细菌 加入200?l细菌裂解液（溶液II）， 颠倒混合离心管内容物，待溶液变粘稠为止。 注： 粘稠 ：开盖后出现拉丝现象，证明DNA已经游出。 （3）（中和：）加入150?l中和液，上下颠倒混合后置 冰上 5min， 12,000转/分， 4℃离心 5min。 碱裂解法提取质粒操作步骤 开始操作： （去除蛋白质） （4） 将上清移至另一离心管中(注意不要混入白色沉淀物)，加入等体积的TE饱和的酚/氯仿/异戊醇(25：24:1)混和液，振荡混匀1min，12,000转/分离心 5min。 （5）将上层水相移至另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)溶液，振荡混匀1min， 12,000转/分 离心 5min 。 （沉淀DNA） （6）将上层水相移至另一离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇， 置-20℃沉淀10－15 min。 １　继续提取质粒： 获取及溶解沉淀的质粒DNA 2　质粒DNA电泳分析： 20 ?l质粒DNA溶液 取出10 ?l放于另一个离心管中备用 剩余10 ?l用于下一步酶