2010实验一二-重组质粒DNA提取、双酶切鉴定、凝胶电泳、紫外分光法.ppt

质粒DNA的提取、纯化、酶切、电泳、 紫外分光光度法定量测定 朱文博 中山医学院 基因工程 定义： 实现基因克隆所采用的方法及相关的工作统称为重组DNA技术，又称重组DNA技术。 2 提取大肠杆菌质粒DNA的方法和原则 2.3 核酸分离纯化的总原则： (1) 保证核酸一级结构完整 (2) 排除其他分子的污染（蛋白质、脂类、 糖、 有机溶剂、金属离子、其他DNA、RNA等） 1.1 影响DNA在凝胶中迁移速率的因素 1 DNA分子的大小 2 构象 3 凝胶浓度 4 电压 5 缓冲液 产生误差的原因： 1.单色性不纯的影响； 2.杂散光的影响； 3.比色皿的影响； 4.温度、pH值的影响； 5.吸光度读数时的误差。 * 3 实验步骤 用0.1×TE 对待测DNA样品按1:20稀释 0.1×TE作为空对照,在波长260nm、280nm、310nm处分别测标准DNA样品的OD值 根据OD值计算DNA浓度（?g/ml） 单链DNA[ssDNA]=33×(OD260－OD310)×稀释倍数 双链DNA[dsDNA]=50×(OD260－OD310)×稀释倍数 4. DNA的纯度鉴定 OD260/ OD280=1.8 （RNA为2 .0） 1.8 可能有RNA污染 1.8 可能有蛋白质污染 * 2006.04.06 3.3 实验步骤 加1.5ml培养物于EP管，12000g×30S ? 除去上清，加入冰的200 μl 溶液I，剧烈振荡EP管，室温3min ? 加入200μl 溶液II，快速颠倒数次，冰浴3min ? 加入150μl 冰溶液III，温和振荡10s，冰浴5min，12000g×5min 转移上清到新EP管，加入等体积酚/氯仿(1:1)，温和振荡，冰浴3min，12000g×5min? 上层水相转移到新EP管，加入2倍体积无水乙醇，颠倒混匀， -20 ℃ 冰箱中放置15min，12000g?10min ? 弃上清，沉淀中加1ml 70%乙醇，12000g×5min 去上清，管平放室温静置10min， 20 μl TE 溶解DNA ? RCF = 1.12r（rpm/1000)2 RCF: 离心力（g） r: 离心半径（mm） rpm: 每分钟转速（r/min） 注意事项： 1、加样枪正确使用； 2、标记自己所提取的质粒类型； 3、废液倒在水池中，枪头扔到垃圾桶中； 4、加不同溶液要换枪头； 5、离心前把管擦干； 6、转移上清时不要吸到沉淀； 7、吸取酚时枪头伸到下层溶液中，注意不要沾到 皮肤； 8、 每人最终得到20ul质粒DNA，其中10ul用于酶 切和电泳，其余10ul用于下次的转化实验，切 记！！！ 二、限制性内切酶切割重组质粒 1 关于限制性核酸内切酶 （restriction endonuclease） 1.1 定义 能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性DNA片段。 主要存在于细菌体内。 切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。 * 1.3 作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。 1.2 分类 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型） 第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。 1.4 命名 Hin dⅢ 属 系 株 序 Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 2 BamHI 、HindⅢ酶切质粒及鉴定 2.1 实验原理： 利用限制性内切酶特异的识别DNA特异的核苷酸序列，并切割DNA,产生一定长度的DNA片段，通过电泳对酶切前后产物分析可以鉴别目的基因（重组质粒DNA） * 重组质粒 BamHI Hind III 双酶切 电泳检测 5-G A A T T C-3‘ 3-C T T A A G-5 BamHI 5-A A G C T T-3 3-T T C G A A-5 Hind III PUC119（3.2Kb） U6启动子（256bp） 2.