实验4-琼脂糖凝胶电泳检测DNA-2010.ppt

一、实验目的 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术，检测上次实验课提取的质粒DNA 二、实验原理 带电物质在电场中的趋向运动称为电泳。凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为蛋白质、核酸研究的首选标准方法 泳动率是带电颗粒在一定的电场强度下，单位时间内在介质中的迁移距离。泳动率与样品分子所带的电荷密度、电场中的电压及电流成正比，与样品的分子大小、介质黏度及电阻成反比。不同大小的带电分子具有不同的泳动率，在不同的介质条件下又具有不同的分辨效率 影响泳动率的因素包括样品的物理性状、支持物介质、电场强度和缓冲液离子强度 DNA的凝胶电泳常使用两种支持介质：琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应 在碱性缓冲液中DNA分子带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动 在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型 琼脂糖凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子 可以分离长度为100bp至近60kb的DNA分子，常采用TAE、TBE和TPE三种缓冲体系 质粒DNA分子有三种构型: CC DNA(共价闭合环状DNA:两条核苷酸链均保持着完整的环形结构，DNA呈现超螺旋 )、 OC DNA(开环DNA： 质粒的一条链断裂) L DNA (线形DNA： 质粒的两条链均断裂)， \ 这三种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的泳动率不同，因此电泳后呈三条带，CC DNA泳动最快，其次是LDNA，最慢的是OCDNA 线性DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度的关系 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种人工合成的凝胶，由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉丙烯酰胺在催化剂过硫酸铵和加速剂TEMED的作用下聚合而成 可以分离小片段（5～500bp）DNA分子 聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用： 蛋白质分子的分离鉴定 蛋白质分子量的测定 核酸的分析 核酸序列测定 三、仪器、材料与试剂 微波炉 琼脂糖凝胶电泳系统 紫外线透射仪 质粒DNA DNA marker 50×TAE 6×凝胶加样缓冲液 琼脂糖 1％溴化乙锭溶液 四、实验步骤 1. 装好制胶装置[用胶带将洗净、干燥的制胶板两端封好(一定封严，不能留缝隙),]使用水平仪，将胶板调至水平，插入适当梳子 2. 将1g 琼脂糖加入100ml 1×TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解（冷却到60℃，加入5μl的1％ EB，并摇匀），则为1％琼脂糖凝胶液 3. 将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入，室温冷却凝固 4. 充分凝固后小心垂直向上拔出梳子，撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中(注意：DNA样品孔应朝向负电极一端)，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶0.5cm 5. 用移液器吸取质粒样品5μl于封口膜上，再加入1μl 的6×加样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔 (记录电样的顺序和电样量) 6. 打开电源开关，调节电压至3～5V/cm，可见溴酚蓝条带由负极向正极移动 (注意DNA片段从负极向正极移动) 7. 当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿1～2cm处，停止电泳 8. 将凝胶置于紫外线透射仪上，打开紫外灯，DNA存在处显出桔红色荧光条带（注意：紫外线对眼睛有伤害作用，应戴上防护眼睛） 五、思考题 EB的中文名称是什么？使用EB时应注意些什么？ 怎么制备一块20mL体积1％琼脂糖凝胶（含溴化乙锭溶液终浓度0.5μg/mL）？ 什么是Loading Buffer？Loading Buffer中含有哪些成分？各组分的作用是什么？ * * 实验四 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 关于电泳 CC DNA LDNA OCDNA 电泳方向 EB：即溴化乙锭，它能够插入DNA分子中的碱基对之间而与DNA结合。由于EB分子的插入，在紫外光的照射下，凝胶电泳中的DNA条带呈现出红色荧光，易于检测。可以检测10ng 的DNA 注意：EB是一种诱变剂，操作时一定要注意安全，必须戴塑料或乳胶手套 GoldView? :是一种可代替EB的新型核酸染料，采用琼脂糖电泳检测DNA时，GoldView?与核酸结合后能产生很强的绿色荧光信号，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，而且也可用于染RNA。 DNA的染料 3 ～0.1 2.0 4 ～0.2 1.5 6 ～0.4 1.2 7 ～0.5 0.9 10 ～0.8 0.7 20